迟缓爱德华氏菌高效疫苗的设计、构建以及免疫机制研究

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1、墨!坠亟YQ!!塾皇i也塾曼坠塾曼堡皇￡塾垒望堕堡墨BySunyunADissertatiOnSubmittedtoUniversit)rofChineseAcademyofSciencesInpartialfulnllmentoftherequirementForthedegreeofDoctor／MasterofMarineBiolog)rInstituteofoceanology；ChineseAcademyofSciencesApril，2013原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作

2、及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任人由本人承担。论羔作者签名：於x日期：∞By～w学位论文版权使用授权书本人完全了解中国科学院海洋研究所有关保留、使用学位论文的规定，同意海洋研究所保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权中国科学院海洋研究所可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手

3、段保存、汇编本学位论文。(保密论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签导师签字签字日期：pf≥，歹、幻签字日期：矽侈t岁-W致谢本文是在导师孙黎研究员的悉心指导下完成的。在这博士三年的学习和实验阶段，孙老师在学习和生活上都给了我许多的帮助和鼓励。她严谨的态度和对科研的执着精神无时无刻不在教育着我感染着我。我的论文从选题、实验设计、数据分析和结果讨论各个方面都渗透着孙老师的辛勤汗水。在此谨向孙老师致以最衷心的感谢。博士三年转瞬即逝，而我即将面对一个新的开始。回顾这几年的学习和实验生活，我收获颇丰。连同硕士三年，我在海洋所共

4、经历了六年的时光，科研上从懵懂到现在的成果累累，生活上也经历了人生的重要阶段。感谢海洋所的领导，感谢研究生部的各位老师。感谢开放室的各位老师在此期间给予的帮助；感谢实验室里胡永华老师、张敏老师、孙铂光老师及迟恒老师。感谢邢明清师姐。感谢实验室的兄弟姐妹们，在实验和生活方面给我的关怀和帮助，在海洋所的学生生涯将是我毕生难忘和永久珍藏的。在此我要特别感谢我的爱人在生活上和学习实验上给我的帮助和支持。感谢我的父母亲人在经济和精神上给我的关心和支持。最后向所有帮助过我的朋友们，一并致谢。摘要迟缓爱德华氏菌高效疫苗的设计、构建以及

5、免疫机制研究细菌性疾病是水产养殖业的重要疾病。迟缓爱德华氏菌(尉w口础抬砌fa砌)是一种革兰氏阴性菌，能够感染多种经济鱼类并引起爱德华氏菌病，给水产养殖业造成巨大的经济损失。本论文主要是以牙鲆为实验动物，开展高效迟缓爱德华氏菌疫苗的设计与构建研究，并且探讨相关疫苗的免疫机制。具体如下：首先通过理论推断与实际实验相结合，本研究筛选出一系列迟缓爱德华氏菌＼免疫保护原，包括Esal、Eta2、Etal等，并在此基础上构建了基于细菌传递的重组亚单位疫苗、DNA疫苗、减毒疫苗和交叉保护疫苗。(1)基于Esal构建重组亚单位疫苗、细

6、菌传递的亚单位疫苗和DNA疫苗：Esal是一个含有795个氨基酸残基的迟缓爱德华氏菌表面抗原，含有多个细菌表面抗原的保守位点且定位于迟缓爱德华氏菌的外膜。我们将Esal在大肠杆菌中表达，获得了重组亚单位疫苗，发现其对迟缓爱德华氏菌引起的牙鲆感染有82％的免疫保护效应。随后我们利用肠道共生菌FP3构建了表面展示Esal的细菌传递疫苗FP3／pJ豫l。发现FP3／pJ踞l作为口服微粒疫苗和注射疫苗分别能达到52％和79％的相对免疫保护率。我们进一步以Esal为抗原，构建成了DNA疫苗pCE阻l。pCEsal免疫牙鲆1个月和2

7、个月后，其免疫保护率分别达到75％和7l％。这些结果表明Esal作为重组亚单位疫苗、鱼类肠道共生菌传递的表面展示型亚单位疫苗以及DNA疫苗皆具有良好的保护效应s(2)基于Eta2构建重组亚单位疫苗和DNA疫苗：在鱼类疫苗研究中，疫苗的免疫机制以及不同类型疫苗的免疫比较研究十分缺乏。本研究筛选得到一个新的迟缓爱德华氏菌免疫保护原Eta2，研究了Eta2作为重组亚单位疫苗和DNA疫苗所诱发的免疫保护效应及免疫机制。我们发现Eta2作为重组亚单位疫苗在免疫牙鲆4周和8周后，可分别产生83％和78％的相对保护率；作为DNA疫苗在

8、免疫牙鲆4周和8周后产生的相对保护率分别为67％和68％。免疫学研究表明此两类疫苗均可增强牙鲆头肾巨噬细胞的杀菌活性、引起特异性和非特异性免疫相关基因上调，以及刺激牙鲆产生特异性抗体，其中亚单位疫苗诱发产生的抗体水平较高。进一步研究表明，Eta2作为重组亚单位疫苗主要引起牙鲆的体液免Ⅱ摘要疫，而作为DNA疫苗则同时引