迟缓爱德华氏菌OppA蛋白的免疫原性及免疫保护分析

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迟缓爱德华氏菌OppA蛋白的免疫原性及免疫保护分析1,21,21,211王妍妍,李贵阳,李杰,肖鹏,莫照兰(1．中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室,山东青岛266071;2．中国科学院研究生院,北京100049)摘要:迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)是水产养殖动物重要的病原菌,引起鱼类爱德华氏菌病,免疫防治是针对该病的一个有效途径。OppA是迟缓爱德华氏菌的一个寡肽透过酶组分,作者开展OppA的免疫原性及免疫保护性的研究,旨在评价其作为鱼类爱德华氏菌病疫苗候选抗原的可行性。将致病性的迟缓爱德华氏菌LSE40的oppA克隆于表达载体pPROEXHTa,转化入大肠杆菌BL21(DE3),表达TM重组蛋白6His-OppA,并利用Ni-NTASefinosekit进行纯化。以纯化的6His-OppA两次注射免疫大菱鲆(Scophthalmusmaximus),第34天后检测血清抗体效价为1:1024;以LSE40对免疫的大菱鲆进行人工感染,测得免疫保护率是25.9%。结果表明,OppA可刺激大菱鲆产生免疫应答,并具有免疫保护效果。关键词:迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda);OppA;原核表达;免疫应答;免疫保护中图分类号:Q939.91文献标识码:A文章编号:1000-3096(2011)05-0019-05迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)是一种革兰德华氏菌病的良好的交叉保护性抗原。在前期工作氏阴性细菌,能引起水生动物发病,感染海水和淡中,本实验室从迟缓爱德华氏菌LSE40fosmid文库[27]水鱼类引起的疾病称为爱德华氏菌病克隆得到编码寡肽透过酶的opp基因簇。本研究(Edwardsiellosis),给养殖业带来重大经济损失[1-4]。通过体外表达迟缓爱德华氏菌OppA,评价该蛋白在利用疫苗预防爱德华氏菌病的研究已取得一些进展,大菱鲆(Scophthalmusmaximus)中的免疫原性和免疫灭活菌体、细胞碎片、表面脂多糖等菌体成分具有保护效果。[5-7]良好的免疫原性,亚单位疫苗、减毒疫苗、DNA1材料与方法[8-14]疫苗显示了良好的免疫保护。由于迟缓爱德华氏菌存在血清型差异,导致一些疫苗的应用效果不稳1.1菌株、质粒、培养基定。筛选具有交叉保护作用的抗原是解决这个问题迟缓爱德华氏菌LSE40由本实验室从患病大菱[8]的一条有效途径。鲆体内分离保存;克隆载体pEASY-T1(氨苄青霉细菌的寡肽透过酶(Oligopeptidepermease,简称素抗性)和大肠杆菌Trans-T1购自北京全式金生物技Opp)由OppABCDF5个蛋白构成,主要负责依赖术有限公司,表达载体pPROEXHTa(氨苄青霉素抗[15]ATP水解的寡肽营养摄取。革兰氏阴性菌的OppA性)来自Invitrogen公司;大肠杆菌BL21(DE3)购自作为底物结合蛋白,能结合多种形式的寡肽,为细天根生化科技(北京)有限公司;胰蛋白胨大豆肉汤[16]菌提供营养,还可作为细胞膜受体,参与其他生培养基(液体TSB和固体TSA)用于培养迟缓爱德华[17][18]理过程的调控,如密度感应,孢子形成,抗生氏菌,LB培养基用于培养大肠杆菌;氨苄青霉素[19][20][21][22]素抗性,菌膜形成,细胞黏附,胞内寄生(Amp)的使用质量浓度为100mg/L。等。一些研究显示,同种细菌的OppA高度保守,作为抗原具有较好的免疫原性,能够不同程度地诱导收稿日期:2011-02-22;修回日期:2011-03-22宿主产生免疫应答,提高宿主针对相应病原的免疫基金项目:国家自然科学基金项目(31072245);国家鲆鲽类产业技术保护力[23-26]。根据NCBI已公布的基因组序列信息,体系项目(NYCYTX-50);青岛市科技发展计划项目(08-1-7-2-HY)作者简介:王妍妍(1987-),女,山东济宁人,硕士,主要从事海洋微爱德华氏菌属的OppA氨基酸序列间相似度较高,生物与水产动物病害防治研究,E-mail:wyy8701@163.com;莫照兰,分布在92%～99%。因此,OppA可能是一个抵抗爱通信作者,电话:0532-82898561,E-mail:zhlmo@qdio.ac.cnMarineSciences/Vol.35,No.5/201119 TM1.2实验动物Sefinosekit(BIOBASICINC.)纯化目的蛋白。以SDS-PAGE检测纯化效果,以Bradford蛋白质定量大菱鲆购自山东青岛胶南养殖场,体长6～8cm,试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)测定纯化蛋白体质量15g左右,暂养于通气的水族箱,水温16～浓度。18℃,每隔两天换水和投喂饵料。实验前随机选取3尾鱼,取血清与迟缓爱德华氏菌LSE40做血清凝集1.5免疫实验实验;同时取鱼的内脏器官匀浆涂布于TSA平板进将大菱鲆随机分成免疫组和对照组,每组30行细菌分离。在确定未出现凝集反应以及未分离到尾。纯化的OppA重组蛋白6His-OppA与等体积完细菌的情况下,该批鱼方能进行后续实验。全弗氏佐剂(Sigma)混合,以30μg6His-OppA/尾鱼1.3OppA表达载体的构建的剂量,对免疫组进行腹腔注射免疫;对照组则以等体积PBS代替6His-OppA,其他条件与免疫组相根据迟缓爱德华氏菌LSE40的opp基因簇序[27]同。第16天进行二次免疫,此时改用不完全弗氏佐列设计上游引物OppA-EcoRI-F(5′-TGAGAATTC-剂,其他处理方法与第一次相同。GCCGAGGTTCCGGCCGGTGTA-3′,下划线为二次免疫后第34天,免疫组和对照组分别随机挑EcoRI内切酶位点)和下游引物OppA-XhoI-R(5′-GCCTCGAGCACGACGCGCAATTAATGTTGAA取3尾鱼,取血清,对照组血清作为阴性对照,以间接[28]CG-3′,下划线为XhoI内切酶位点),扩增oppA基因ELISA方法检测免疫组血清抗体效价。其余的鱼以4的1583bp片段,该片段去除了编码OppAN端信号浓度为2.73×10cfu/尾的LSE40进行腹腔注射攻毒。肽的81bp。所得PCR产物克隆到pEASY-T1载体,观察并记录死鱼数量,根据公式计算免疫保护率:转化大肠杆菌Trans-T1,在LB+Amp固体平板培养基免疫保护率=(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×[29]上进行蓝白斑筛选,挑取白色菌落经扩大培养,提100%。质粒进行EcoRI/XhoI双酶切,选择插入片段大小符2结果合的阳性重组质粒送上海博尚生物技术有限公司进行测序。确认克隆序列的正确后,将插入片段连接到2.1OppA表达载体构建表达载体pPROEXHTa,转化大肠杆菌BL21(DE3),以筛选的BL21/HtaOppA作菌落模板,以OppA-经LB+Amp培养基筛选阳性菌落,进行扩大培养,EcoRI-F/OppA-XhoI-R扩增得到的片段大小为1.6kb提取质粒经EcoRI/XhoI双酶切和OppA-EcoRI-左右(图1a)。该DNA片段去除了OppA蛋白N端27F/OppA-XhoI-R为引物的PCR扩增鉴定插入片段。含有正确重组质粒的菌株命名为BL21/HtaOppA;同时将空质粒pPROEXHTa转化到BL21(DE3),获得对照菌株BL21/Hta。1.4OppA重组蛋白的诱导表达及纯化以37℃、1mmol/LIPTG诱导培养BL21/Hta-OppA,同时设BL21/HtaOppA未诱导对照及BL21/Hta空质粒对照,SDS-PAGE(12%分离胶和5%图1重组表达菌株BL21/HtaOppA的构建和鉴定浓缩胶)检测目的蛋白表达情况。对BL21/HtaOppAFig.1Constructionandidentificationofrecombinant进行表达条件的优化,设置条件为:IPTG诱导浓度strainBL21/HtaOppAa.PCR扩增oppA片段;1.BL21/HtaOppA为菌落PCR模板;2.阴0.8、0.4、0.2mmol/L,诱导温度20、26、30、37℃,性对照;M.DNAmarker;b.重组质粒pPROEXHTaOppA的诱导时间3、4、5h,3要素形成36个组合。每组实EcoRI/XhoI双酶切鉴定;1.重组质粒pPROEXHTaOppA的验均以BL21/Hta为对照。诱导培养的细菌菌液经超EcoRI/XhoI双酶切图谱;M.DNAmarker声波破碎、离心,SDS-PAGE检测上清和沉淀,根据a.PCRamplificationofoppA;1.PCRamplificationusingBL21/HtaOppAasatemplate;2.negtivecontrol;M.DNAmarker;蛋白表达量的情况确定其中最优的诱导条件组。按b.IdentificationoftherecombinantplasmidpPROEXHTaOppAdigestedwithEcoRIandXhoI;1.Restrictionprofilesoftherecom-照优化的诱导表达条件对BL21/HtaOppA大量培养binantplasmidpPROEXHTaOppAdigestedwithEcoRIandXhoI;(300mL),5000g离心6min收集菌体,以Ni-NTAM.DNAmarker20海洋科学/2011年/第35卷/第5期 个氨基酸的信号肽编码区,目的是提高6His-OppA以0.4mmol/LIPTG诱导4h,此时约有80%的可溶在大肠杆菌的表达量。同时,BL21/HtaOppA中的质性重组蛋白存在于细胞破碎物的上清(图2b),经纯粒经EcoRI/XhoI双酶切产生1.6kb左右的DNA片化,获得了高纯度的目的蛋白(图2c)。段(图1b),与预期的片段大小一致,表明成功获得2.3血清抗体效价及免疫保护率OppA重组表达菌株BL21/HtaOppA。大菱鲆经两次免疫,在加强免疫后的第34天,2.2OppA重组蛋白的诱导表达及条件优化检测得到的免疫大菱鲆血清抗体效价是1:1024。免实验中发现,经1mmol/LIPTG、37℃条件诱疫组和对照组经LSE40毒株攻毒,如图3所示,对照导的BL21/HtaOppA,6His-OppA成功表达(图2a),但组于攻毒后的第8天开始出现死亡,免疫组于攻毒是主要以包涵体形式存在于细胞沉淀,只有30%左后的第11天开始出现死亡;在攻毒后第22天,两组右的可溶蛋白存在于细胞上清。为提高可溶蛋白含累积死亡率均趋于稳定,此时免疫组累积死亡率为量,作者优化了细菌的培养温度、培养时间和IPTG74.1%,对照组为100%,且免疫组死亡时间明显延诱导浓度,优化得到的条件为:在26℃培养条件下,后(P<0.01),计算得到的免疫保护率是25.9%。图2SDS-PAGE检测OppA重组蛋白的表达及纯化Fig.2SDS-PAGEof6His-OppAinbacterialysatesandinelutionbuffera.OppA重组蛋白的SDS-PAGE检测;M.proteinmarker;1.BL21/Hta总蛋白(诱导);2.BL21/Hta总蛋白(未诱导);3.BL21/HtaOppA总蛋白(诱导);4.BL21/HtaOppA总蛋白(未诱导);b.BL21/HtaOppA菌株OppA重组蛋白的可溶表达优化;M.proteinmarker;1和3.BL21/HtaOppA超声破碎后分离的沉淀和上清(1mmol/LIPTG、37℃诱导4h);2和4.BL21/HtaOppA超声破碎后分离的沉淀和上清(0.4mmol/LIPTG、26℃诱导4h);c.纯化重组OppA的SDS-PAGE检测;M.proteinmarker;1～5依次是过柱纯化得到的OppA重组蛋白1～5管洗脱液a.analysisof6His-OppAinbacteriallysates;M.proteinmarker;1.totalcellularproteinsofBL21/Hta(induced);2.totalcellularproteinsofBL21/Hta(uninduced);3.totalcellularproteinsofBL21/HtaOppA(induced);4.totalcellularproteinsofBL21/HtaOppA(uninduced);b.op-timizationofsoluble6His-OppAexpressedinthestrainBL21/HtaOppA;M.proteinmarker;1and3.precipitateandsupernatantisolatedfromultrasonicationproductofBL21/HtaOppA,respectively(inducedat1mmol/LIPTG,37℃for4h);2and4.precipitateandsupernatantisolatedfromultrasonicationproductofBL21/HtaOppA,respectively(inducedat0.4mmol/LIPTG,26℃for4h);c.analysisof6His-OppAinelutionbuffer;M.proteinmarker;1～5.eluatecollectionof6His-OppA3讨论本研究利用大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),将迟缓爱德华氏菌OppA蛋白编码基因克隆到表达质粒pPROEXHTa的6His标签之后,获得重组蛋白6His-OppA。由于诱导表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白纯化过程中需经变性和复性处理,将会增加操作难度,所以我们进行了表达条件的优化。通过降低诱导时的培养温度以及IPTG浓度,有效减少包涵体生成,使可溶性蛋白含量由30%提高到80%。图3以迟缓爱德华氏菌LSE40攻毒后的大菱鲆累积死亡率本实验表明,迟缓爱德华氏菌OppA重组蛋白Fig.3AccumulativemortalitiesofturbotafterchallengedwithE.tardaLSE40作为抗原,能使大菱鲆产生特异性免疫应答,并起MarineSciences/Vol.35,No.5/201121 到一定的免疫保护作用,这与鼠疫耶尔森菌againstEdwardsiellatardaantigens[J].FishPathology,(Yersiniapestis)和卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)1983,18(3):135-141.的OppA蛋白免疫小鼠的结果较一致[23,26]。根据结[8]LanMZ,PengX,XiangMY,etal.Constructionand果,本实验从免疫鱼获得的血清抗体效价(1:1024)characterizationofalive,attenuatedesrBmutantofEdwardsiellatardaanditspotentialasavaccine低于鼠疫耶尔森菌和卡他莫拉菌的OppA免疫小鼠againstthehaemorrhagicsepticaemiainturbot,获得的血清抗体效价(1:10000～1:32000)。这种血Scophthamusmaximus(L.)[J].FishShellfishImmunol,清抗体效价的差异可能是因为大菱鲆与小鼠相比,2007,23(3):521-530.免疫系统相对不完善,免疫应答能力比小鼠弱。另外,[9]LiuY,OshimaS,KuroharaK,etal.Vaccineefficacyof体外表达抗原的结构变化、免疫剂量、免疫佐剂类recombinantGAPDHofEdwardsiellatardaagainst型以及免疫途径等,都可能导致免疫应答水平和免Edwardsiellosis[J].MicrobiolImmunol,2005,49(7):[26]疫保护效果的不同。最近的一个研究显示,通过黏605-612.膜免疫途径免疫卡他莫拉菌的OppA蛋白,提高了[10]VerjanN,HironoI,AokiT.Geneticlociofmajor小鼠清除肺部致病性病原的能力[23]。antigenicproteingenesofEdwardsiellatarda[J].ApplEnvironMicrobiol,2005,71(9):5654-5658.ABC输送器家族蛋白被认为是潜在的针对病原[24][11]WangB,MoZL,XiaoP,etal.EseD,aputativeT3SS菌的疫苗候选抗原或药物作用靶点。Opp为ABCtransloconcomponentofEdwardsiellatarda,输送器家族的一员,其在抵抗病原侵染方面的功能contributestovirulenceinfishandisacandidatefor日益受到人们的关注。通过本实验得到的初步结果,vaccinedevelopment[J].MarBiotechnol(NY),2010,OppA在大菱鲆显示了一定的免疫应答和免疫反应。12(6):678-685.作者下一步将在免疫剂量、免疫佐剂类型以及免疫[12]JiaoXD,ZhangM,ChengS,etal.Analysisof途径等方面开展工作,以期提高该蛋白的免疫应答EdwardsiellatardaDegP,aserineproteaseanda和免疫保护力,达到控制爱德华氏菌病的目的。protectiveimmunogen[J].FishShellfishImmunol,2010,28(4):672-677.参考文献:[13]JiaoXD,DangW,HuYH,etal.Identificationandimmunoprotectiveanalysisofaninvivo-induced[1]董传甫,林天龙,陈日升.日本鳗鲡败血腹水病病原Edwardsiellatardaantigen[J].FishShellfishImmunol,研究[J].水产科学,2002,21(1):5-8.2009,27(5):633-638.[2]李筠,颜显辉,陈吉祥,等.养殖大菱鲆腹水病病原[14]JiaoXD,ZhangM,HuYH,etal.Constructionand的研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2006,evaluationofDNAvaccinesencodingEdwardsiella36(4):649-654.tardaantigens[J].Vaccine,2009,27(38):5195-5202.[3]薛淑霞,冯守明,孙金生,等.海水工厂化养殖大菱[15]DetmersFJM,LanfermeijerFC,PoolmanB.Peptides鲆(Scophthalrnusmaximus)和褐牙鲆(ParalichthysandATPbindingcassettepeptidetransporters[J].Resolivaceus)腹水病病原菌的分离与鉴定[J].海洋与湖Microbiol,2001,152(3):245-258.沼,2006,37(6):548-554.[16]MonnetV.Bacterialoligopeptide-bindingproteins[J].[4]张晓君,战文斌,陈翠珍,等.牙鲆迟钝爱德华氏菌感染CellMolLifeSci,2003,60(10):2100-2114.症及其病原的研究[J].水生生物学报,2005,29(1):31-37.[17]AlloingG,MartinB,GranadelC,etal.Developmentof[5]FengSM,ZhanWB,ShengXZ,etal.ResponseofcompetenceinStreptococcuspneumonaie:pheromonemucosalandsystemicsIgM-positivecellsinturbotautoinductionandcontrolofquorumsensingbythe(ScophthalmusmaximusL.)immunizationwitholigopeptidepermease[J].MolMicrobiol,1998,29(1):Edwardsiellatarda[J].VetImmunolImmunopathol,75-83.2009,129(1-2):108-114.[18]RudnerDZ,LedeauxJR,IretonK,etal.Thespook[6]GutierrezMA,MiyazakiT.ResponsesofJapaneseeelslocusofBacillussubtilisishomologoustothetooralchallengewithEdwardsiellatardaafteroligopeptidepermeaselocusandisrequiredforvaccinationwithformalin-killedcellsorsporulationandcompetence[J].JournalofBacteriology,lipopolysaccharideofthebacterium[J].Journalof1991,173(4):1388-1398.AquaticAnimalHealth,1994,6(2):110-117.[19]AcostaMB,FerreiraRC,PadillaG,etal.Altered[7]SalatiF,KawaiK,KusudaR.Immuneresponseofeel22海洋科学/2011年/第35卷/第5期 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