奉节脐橙果皮褐变生理及相关基因的分离研究

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1、中文摘要摘要奉节脐橙(CitrussinensisOsbeek)是一种优良的甜橙鲜食品种，在国内外市场享有较高声誉，是重庆市柑橘出口中唯一具有较强竞争优势的品种。但奉节脐橙果皮褐变发生较严重，主要症状为油胞破裂下陷、形成褐斑，极大地影响了果实的外观质量和商品价值。目前对脐橙果皮褐变的发生机制尚未进行深入研究，缺乏相应的控制措施，这己成为目前脐橙商品生产发展的关键制约因素。因此迫切需要开展果皮褐变的生理及分子机制研究。本研究以‘奉园72．1’脐橙为材料，果实采后分别采用常温(15"0)贮藏(对照)、低温(5℃)贮藏、打蜡或机械损伤后

2、常温保藏。贮藏lO周，每周测定一次生理指标。果皮褐变率统计结果显示，打蜡和机械损伤能加速果皮褐变的发生，5"12低温贮藏可以减少果皮褐变。对过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性研究发现，果皮褐变最严重的损伤果POD和PPO活性较高；打蜡促进PPO活性上升，而低温能有效抑制PPO活性．对苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性研究发现，PAL活性与果皮褐变率之间高度相关，损伤处理PAL活性最高。通过半定量RT-PCR方法研究pal基因在机械损伤和果皮褐变过程中的作用，发现损伤能增强pal2基因表达，且褐变果中pal2的表达明显强于未褐

3、变果；pal6基因的表达模式与pal2相似，即在损伤果和褐变果中均表达增加，但pal6基因的表达水平明显低于pn乜。因此我们认为队L活性及pal基因表达与脐橙果皮褐变之间具有密切关系，在果实受到损伤和果皮褐变过程中，pal2基因对PAL酶活性的影响强于pal6基因．在第二次生理落果结束后进行叶面喷钙结合单果套袋处理可显著降低果实采后果皮褐变的发生，提高果实外观质量和商品性。综合以上研究结果发现：田间喷钙、套袋处理后适期采收，在采后处理及贮运中尽量减少机械损伤，采用适宜低温冷藏可有效减轻脐橙果皮褐变的发生。为了探明脐橙果皮褐变的分子

4、机制，分别以褐变与未褐变的果皮mRNA作为检测方和驱动方，利用抑制差减杂交(sSH)技术，构建了脐橙果皮褐变正向差减eDNA文库。SSH文库中阳性克隆92个，阳性克隆比例为70％，重组子插入片段大小主要分布在150bp．600bp之问．随机挑取部分阳性克隆测序，测序结果利用NCBI的BLASTn和BLASTx在线软件进行序列相似性分析。在50个已经浸9序的克隆中单一克隆为28个，其中有22个在GenBank中具有同源序列，占单一克隆数的78．6％，另有6个未找到同源序列，可能代表了新基因。同源基因中包含了与物质代谢、成熟衰老以及胁

5、迫病害相关的蛋白质，说明柑橘果皮褐变的发生是一重庆人学博士学位沦文个涉及到衰老、胁迫反应、信号转导等多方面的复杂的生理生化过程。以柑橘管家基因ubiquitin为内对照，通过半定量RT-PCR方法鉴定差减文库中分离的钙结合蛋白基因、半胱氨酸蛋白酶基因、NAC-：I或蛋白基因、胁迫与病害相关蛋白基因和膨胀素基因是否为果皮褐变差异表达基因，结果显示它们均在褐变果皮中有上调表达，说明这些基因表达的增强可能与果皮褐变密切相关。为了进一步获得果皮褐变相关基因的信息，采用RACE技术克隆了3个果皮褐变差异基因的全长eDNA序列：(1)脐橙膨胀

6、素基因CsEXP(GenBank登录号DQ665898)，全长1077bp，编码252个氨基酸，分子量为26．86kDa，等电点为7．93。同源性分析显示CsEXP与膨胀素(Expansin)具有很高的同源性，具有ct-Expansin蛋白的保守序列，即c．端的缸y残基，序列中央的HFDmotif以及N一端的eys残基；生物信息学分析表明其N．端具有一信号肽序列，跨膜预测结果表明该蛋白的N端4．23aa处有一跨膜结构．(2)脐橙胁迫与病害相关蛋白基因CsSPR(登录号EF010853)，全长679bp，编码161个氮基酸，分子量为

7、17．60KDa，等电点为5．74。没有信号肽序列和跨膜区。具有病害相关蛋白的保守结构域BetV1．(3)脐橙钙结合蛋白基因CsCAB(登录号EF010854)，全长984bp，编码207个氨基酸，分子量为22．95KDa，等电点为4．5，没有信号肽序列和跨膜区。具有钙结合蛋白的保守的两个EF-hand结构域。以CsEXP、CsSPR、CsCAB基因的3’．非同源区标记同位素32P为探针，分别与褐变、非褐变果皮RNA进行Northern杂交；另外，以CsEXP3"-非同源区为探针，与400、400C、伤害、0％02、3％02和乙烯

8、处理后6h，12h，24h的果皮RNA进行Northern杂交，结果显示，DE扭，CsSPR，CsCAB在褐变果皮中的表达均明显高于对照，进一步证实它们属于果皮褐变相关基因；CsEXP在胁迫初期的表达分析显示，高温(400c)抑锘IjCsEXP的表