丝状真菌组织DNA的提取

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1、维普资讯http://www.cqvip.com生物技术9(6)：38—41，1999Bioteehrmlc~丝状真菌组织DNA的提取韩利刚袁毅王罡第二军医大学南京军医学院席原学教研室。南京．210099)(解敛军墩牧大学裹学系，长謇．130062)用CrAB法直接从熊收真茵的新鲜茵篮中提取DNA，井将所提取DNA进行随机引糟多态性扩增(RAPD)，得到了较清晰的扩增图谱，证明谊法为提取真茵DNA以用于分子生物学研究的一种有效方法。关键词：DNA提取，丝状真茼，褂D法站见呈诸要报道，如种Cr提AB取法及氯化苄法等⋯1。1材料与方法各种

2、方法因所提DNA的用途不同而各异，1．1材料但基本原理一样。由于D】A分子量较太，1．1．1供试菌种：共2属8种l1个菌株，其结构复杂，提取过程易降癣、变性，我们在参中lO种来自中国医学科学院皮肤病研究所考前人工作基础上建立了一种适合丝状真菌(ID)，1种由本室分离培养。详见表1。DNA提取的较为简便、易行、可靠的方法。裹】RAPD研究供试一种／洼：D为中国压学科学院皮肤霸研究所1．1．2主要试剂：2×CTAB缓冲液t2％7MNaC[；CrAB沉淀缓冲液：1％CRAB(w／CTAB(w／w)+100mMTris(pH8．0)+1．4M

3、+50mMTris(pH8．0)+10mMEDTANaCI5％CTAB溶液：5％CTAB(w／w)+0．(pH8．0)；高盐TE缓冲液；10mMTris(pH8．0)+lmMEDTA(pH8．0)+1MNaCl；1×TE缓冲液；10mMT出(口H8．0)+lmM收稿日期：1999—02—10．惨回日期}1999—0B一07ED'rA(!al8．0)；95％乙醇；80％乙醇；氯仿／异戊醇混合液：24：1(v／v)(4℃贮存)；液氟；维普资讯http://www.cqvip.com生物技术9(6)：38～41，1999Bioteckdog

4、y引物，购白上海细胞所癌基因研究室；Taq30s。如溶液其呈微弱的云雾状或溶液依旧酶，购白中国科学院遗传所。很清，刚产量低，需离心1—5rain。弃去上清1．1．3主要仪器：日本MDEL7930型高速液。将片状l沉淀在高盐TE缓冲液中溶解。冷冻离心机；．rD236型PCR仪；电泳仪c加入20xTE缓冲液溶解小的片状沉淀，1．2方法50ul溶解中等片状沉淀，100gl溶解大的片1．2．1样品处理：将供试菌种接种于PDA状沉淀。65℃水潜5rain，用手轻弹以溶解片平板，置25℃恒温籍中培养约4周。用无菌状沉淀。如果片状沉淀不能完全溶解，

5、可加接种针在平板上挑取约lg新鲜茁丝至一干入更多的高盐TE缓冲液。加入总量不要超净研钵中。尽量避免挑到培养基。在研钵中过500。如还不能完全溶解，移出上清液。饲人液巍。用研杆将菌体组织／液氮混合物加入2倍体积的95％冷乙醇至上清液中，轻迅速充分研磨。将研磨后的茵体组织／蒗氮轻混合。离心5rain，如无沉淀，离心的时间混合物粉末移至一微型离心管(1000)中。可长一些。弃去上清液。加入一个体积的80％乙醇，混合并离心3—5rain，弃去上清液。在干燥器中干燥20—30rain，直至所有的液体都蒸枯完。在1X，IE中重新溶锵片状沉淀。小量

6、沉淀加入20gl，中等沉淀加入50，大的沉淀或更多时，加入100~I。08％凝胶电泳检测。置一20℃下保存。1．2．3In浓度测定：姒—DNA为标准。以琼脂糖凝腔电泳方式进行对其浓度测定。制备较薄的0．8％琼脂糖凝腔。剪取一条Parafilrn包装膜．在无菌干净的一面．按所需要的点样个数在上面顺序点加Loading田111十曹糠的DNA皂谏圈【左一为江(O．2ug)lbu{fe~各1滴(约2)。制备—DNA浓度崔：备加样孔的加样■序见表1如不马上提取，可贮存于一舯℃冰箱。标准梯度，取公司标准浓度—DNA(0．38,ugI)，分别向上步

7、滴加的LB上逐个1．2．2DNA提取：在离心管加入65℃加入0．2,u．g、0．4g、0．6g。点样所提样品CAB缓冲液，体积与离心管内物质体积近DNA各1，按顺序点在上步不同LB滴上。似相等(约400~1左右)。将离心管置于65℃记下位置，用吸头轻轻吸打混匀，然后小心加水浴lrnin。如水浴后混合物呈胶粘湿滑状。入胶槽中进行电泳。在溴酚蓝带达到胶槽的则将离心管继续置于65℃水浴至少3—5rain1／'3处，停止电泳。将胶放人0．5gg／rnl溴化(长可至20n)。加入1个体积(等于管内乙锭中染色5—10mln，在清水中浸泡lmin，

8、内含物当前总体积)的氯仿／异戊醇混台液。在紫外光下观察并记录结果。彻底混合形成完全的乳浊液。1l，000g离心I．24兔：以所提丝状真菌的DNA为3os。转移上清液至一新微型管中，加入1／5模板，进行乳'D扩增。体积的5