微波法快速提取丝状真菌基因组dna论文

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1、微波法快速提取丝状真菌基因组DNA论文田永强苏敏赵洪林邵洋左炀陈小林何钊刘立新冯兴赵子翰褚以文【摘要】丝状真菌基因组DNA的提取是一个费时、费力，并且费用较高的工作，效率较低。本文报道一种以微波热振破壁处理真菌菌丝，快速、简便和高效提取真菌基因组DNA的方法。以提取的DNA为模板可以扩增出18SrRNA基因。【关键词】微波法；丝状真菌；基因组DNA提取；丝状真菌广泛存在于自然界中，在工农业生产中占据非常重要的地位［1］。丝状真菌资源的开发需要对大量的菌种进行快速筛选、鉴定和改良。分子技术的发展使对真菌进行快速和高效鉴定与改良成为现实，

2、因此迅速、方便、实惠的真菌DNA提取就显得相当重要。真菌因为有不同于细菌的细胞壁，而且真菌中有较多的多糖成分影响到所提DNA的质量和后续的分析。平常的方法如提取放线菌、细菌的DNA方法不适合真菌基因组DNA的提取，而常用的酶法或液氮破壁的方法在实际操作中因为成本和储存条件的问题使其应用受到局限。许多学者对丝状真菌基因组DNA的提取方法进行了摸索和改进［2.freelmol/LTrisHCl，pH7.7，25mmol/LEDTA，0.1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；裂解液为50mmol/LTrisHCl，pH8.0，25mmol/LE

3、DTA，3%SDS，1.2%PVP；抽提液为10mmol/LTrisHCl，pH8.0，1mmol/LEDTA，0.3mol/LNaAc，1.2%PVP；18SrRNA基因扩增引物为F181f(5′ACCTGGTTGATCCTGCCAG3′)和F182b(5′ATCCTTCCGCAGGTTCACC3′)由上海生工合成，表1实验菌株编号菌种菌号1StachybotryschlorohalonataSIIA15072StachybotrysdichroaSIIA15503AspergilluscarbonariusSIIA1

4、5844Aspergillussp.SIIA17098PenicilliumbrevipactumSIIA17159PenicilliumbrevipactumSIIA174610PenicilliumexpansumSIIA170811Mariannaeasp.SIIA1299712NectriamariannaeaeSIIA1236113GibberellafujikuroiSIIA14231SIIA：中国医药集团四川抗菌素工业研究所抗生素微生物资源中心。Taq酶购自北京天根公司。丝状真菌斜面培养选用PDA培养基，菌丝收集选用液体

5、培养基，成分为：水解酪素0.05g，蔗糖1.5g，酒石酸铵0.5g，NH4NO30.1g，K2HPO40.1g，NaCl0.01g，CaCl20.01g，H2O100ml；pH自然。1.2方法(1)菌体准备将菌种接种于PDA斜面培养基上，26℃培养3d，挑菌于100ml液体培养基中，在220r/min的摇床上于26℃培养3～4d，离心收集菌体，用无菌蒸馏水洗涤菌丝3次，保存于-20℃冰箱。(2)DNA提取用无菌竹签挑取菌丝体1g加入研钵中，加入300μl的缓冲液，并加入预先准备好的0.5g的酸洗石英砂，研磨至菌落分散至单个细胞，即无成

6、团菌丝体存在。将研磨液吸入1.5ml的灭菌EP管中，加入100μl预热至35℃的裂解液，并且震荡摇匀5s，将EP管的盖子打开，放入功率为600g2+，终浓度为100pmol的引物，2μl250mmol/LdNTP。反应程序为：95℃4min，95℃1min，50℃1min，72℃2min，30个循环，循环结束后72℃延伸10min，反应在BioRad公司的Mycycler上进行。2结果与讨论利用微波对6个属的13株丝状真菌进行DNA抽提研究，发现可以非常简便的抽提出基因组DNA，在电泳图上可以看见20kb有清晰的条带(图1)，并且以

7、抽提出的DNA为模板，可以有效地扩增出18SrRNA基因(图2)。真菌的破壁方法很多，常见的有液氮研磨和酶法溶胞，这两种方法都有各自的局限性，液氮不容易保存和使用，针对少量的样品而购买和储存液氮显得麻烦，一般的实验室也很少有液氮储存罐。酶法主要采用蜗牛酶和溶壁酶破壁［5］，由于酶类较昂贵所以成本较高。我们的实验中对不同真菌的酶法处理效果不理想。有的实验室用溶壁酶处理，也是因为不易购买和价格过高而不能普遍运用。Orsini等［6］较早运用微波法直接从土壤等环境样品提取细菌基因组DNA，可有效提取环境生物的基因组DNA，微波法提取基因组D

8、NA在放线菌中已有运用［4］，本研究证实微波法对真菌基因组DNA的提取也有较好的结果，微量的菌种就可以提出相当好的DNA，而且条带清晰。能很好的用于后续的基因扩增。微波法提取真菌DNA有很多优点：①耗材少，费以微波法提取