真菌dna大量提取

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1、核裂解法大量提取真菌DNA一、试剂的配制1.EDTA-Na2（0.1M）：称取3.72gNa2EDTA·2H2O，用超纯水定容至100mL。2.Tris-HCl（1M，pH）：称取12.11gTris-HCl，用90-95mL超纯水溶解，调pH至8.0后，在定容至100mL。3.核裂解液(10mMTris-HCl,400mMNaCl，2mMEDTA-Na2，0.8mM盐酸胍)：分别称取76.43g盐酸胍，23.38gNaCl于1L烧杯中，加入灭菌超纯水充分搅拌溶解至900mL，再加入10mL1MTris-HCl和20mL0.1MEDTA-Na2，搅拌溶

2、解，调pH至8.0，定容至1000mL，高温灭菌，冷却待用。4.SDS（20%）：称取20gSDS，灭菌超纯水定容至100mL。（SDS不能采用高温高压灭菌）5.盐酸胍：强烈变性剂，可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸上解离下来，此外，RNA酶可被盐酸胍等还原剂灭活。二、操作步骤1.称取液体培养基PPDA培养样品1.0-1.5g（可用灭菌超纯水或TE缓冲液清洗1-2次），研钵先用液氮预冷，再将样品用液氮研磨，直至全部研磨成均匀粉末。2.转入预装5mL(与样品质量比为1:4-1:6)核裂解液的15ml离心管中，加入60μl50mg/

3、mL蛋白酶K（80-150μl，20mg/mL），10μlRNaseA充分震荡15s混匀。3.加入500μl20%SDS（终浓度1%-5%），震荡混匀。4.56-65℃水浴，约3h，至出现较多上清，期间不断颠倒混匀。5.冷却后，4℃，6000rpm，离心10min，吸取上清至另一新的15mL离心管中。6.加入10μlβ-巯基乙醇（终浓度0.02%），再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒混匀30次左右，6000rpm，离心10min。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡）1.吸取上清至另一新的15mL离心管，注意不要

4、吸到中间蛋白层。2.如果上清十分浑浊，可用等体积氯仿/异戊醇（24:1）再抽提一到两次，同样6000rpm离心10min，将上清转至新的离心管。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡）3.加入等体积-20℃预冷的异丙醇（可先加入1/10体积3M，pH5.2的NaAc，沉淀效果更好），轻柔颠倒混匀，如果DNA沉淀呈絮团状，可用移液枪枪头或干净玻璃棒将DNA絮状沉淀挑出，若DNA不呈完整絮状沉淀或沉淀较少，可在-20℃冰箱放置1-2h促沉淀。4.若DNA沉淀无法直接挑出，可4℃，6000rpm，10min收集沉淀，弃尽上清，挑出DNA沉淀

5、。5.将DNA沉淀转入2mLEP管，加入1mL预冷的70%乙醇，轻弹管壁重悬沉淀。混匀洗涤2-3次，以去除残余的盐，12000rpm，2min弃尽上清。6.加入1mL预冷的无水乙醇，轻弹管壁重悬沉淀；12000rpm，离心2min。（动作轻柔，不可剧烈震荡，避免造成DNA断裂）7.室温放置10-15min左右，使乙醇完全挥发，加入适当体积的灭菌超纯水或TE缓冲液溶解。CTAB法大量提取真菌基因组DNA一、试剂的配制1.CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（PH8.0）：2%CTAB（w/v），1.4MNacl，0.02MEDTA，0.1MTris-c

6、l，0.2%巯基乙醇。即称取CTAB2g加蒸馏水40ml，加1MTris-cl（PH8.0）10ml，0.5MEDTA（PH8.0）4ml和5MNaCl28ml（约8.19gNaCl），于65℃下溶解，用蒸馏水定容到100ml，最后pH值8.0，灭菌后加入0.2mlβ-巯基乙醇。2.1MTris-cl（PH8.0）：12.11gTris碱；ddH2O，80ml；HCl，4.9ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0，定容至100ml。3.0.5MEDTA（PH8.0）：在80ml水中加入18.01gEDTANa2·2H2O搅拌溶解，用NaOH调

7、PH至8.0（约2gNaOH颗粒），定容至100ml。4.5MNaCl100ml：称取29.22gNaCl，用ddH2O定容到100ml。5.3MNaAc10ml：称取2.46gNaAc，用ddH2O定容到10ml，pH5.2。6.TE溶液：Tris-HCl（pH=8.0，1mol/L）5ml，EDTA（pH=8.0，0.5mol/L）1ml，加ddH2O定容到500ml，PH8.0。二、操作步骤1.称取液体培养基PPDA培养样品1.0g，研钵先用液氮预冷，再将样品用液氮研磨均匀，直至全部研磨至粉末，转入15ml离心管中，加入4mL(与样品质量比为1:

8、4-1:6)65℃预热的CTAB溶液（用前加入0.2%的β-巯基乙醇），充分振荡混匀。2.65