外源性TGFβ1对活化的大鼠肝星状细胞内Smads蛋白表达的影响

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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意．申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任．论文作者簦名：墨生EI摊I：迦￡：』：丛中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识

2、产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：。_“P⋯⋯{中文论著摘要j、．_-．，．，．，●．-．．。．．·．．．·．．‘．_．．●．．。●。．。●“，一’外源性TGF—B。对活化的大鼠肝星状细胞Smads蛋白表达的影响前言肝纤维化是指肝脏内细胞外基质(ex

3、traeellularmatrix，ECM)的过度沉积。近年来的研究表明，在众多的致纤维化细胞因子中，转化生长因子一B(transforminggrowthfactor一13，TGF一13)的促纤维生成作用最强；活化的肝星状细胞(hepaticsteUatecell，HSC)则是肝脏内最主要的纤维生成细胞。Smads蛋白家族作为细胞内信号转导蛋白，是迄今唯一已被证实的TGF一母受体(TGF—Dreceptor，T13R)作用底物。近年来，众多研究已经证实TGF—B在肝纤维化形成过程中的致纤维化作用。而Smads蛋白在这一过程中究竟充当了什么角色，目前还不是

4、很清楚。本项研究运用蛋白免疫印迹杂交方法(Westernblotting)研究在外源性TGF—B。的刺激下，体外培养的活化的大鼠HSC内磷酸化Smad2或Smad3(phospho—Smad2or—Smad3，P—Smad2or—Smad3)与Smad7表达的变化，阐明有TGF—B，刺激的条件下，活化的大鼠HSC内P—Smad2或一Smad3和Smad7这两类细胞内信号转导蛋白表达变化的特点，进一步认识促肝纤维化的细胞内分子机制，为寻找防止肝纤维化新的治疗靶点提供实验依据。材料与方法在本研究中，我们对活化的大鼠HSC进行体外培养，然后分别选取生长状态良好的

5、不同的三代细胞，用含TGF—B，(浓度5rig／m／)的无血清HSC培养液与活化的大鼠HSC共同培养0小时、0．5小时、1小时、4小时、8小时、24小时后，分别弃去培养液，先后加入细胞裂解液100“l、PMSF41xl、Aprotinin1止，于冰上静置20分钟，然后用橡皮刮将细胞刮下，收于微量离心管中，在4。CT，10000×g离心15分钟，保留上清液，置于一130℃冻存待用。应用Westemblotting方法检测上述获得的蛋白样品中P—Smad2或Smad3和Smad7表达的情况。将获得的蛋白电泳条带用天能GIS凝胶图象处理系统进行半定量分析，用SP

6、SS统计软件对以上结果进行方差分析。实验结果TGF—t3,对活化大鼠HSC内Sraads蛋白表达影响的研究采用TGF—B。(浓度为5ng／m1)与活化的大鼠HSC共同培养0小时、0．5小时、I小时、4小时、8小时、24小时后，活化的大鼠HSC内P—Smad2或Smad3／13一Actin检测值分别为0．84±0．11、0．97±0．09、1．02±0．16、1．12±0．19、1．27±0．26、1．17±0．26；SmadT／f3一Actin检测值分别为0．714-0．22、O．85±0．31、0．91±0．32、1．07-4-0．36、1．38±0．4

7、8和1．29±0．59。以上结果表明，经外源性TGF—B，刺激后，活化的大鼠HSC内P—Smad2或一Smad3与Smad7蛋白表达均呈一过性增加，并且它们的表达水平均在8小时达到高峰之后开始下降。经方差分析，TGF—B，刺激8小时和24小时组P—Smad2或Smad3／13一Actin值与刺激0小时组比较有显著性差异，P值分别为0．014和0．048，而与其他组比较无显著性差异；总的F=4．667，P=0．034，也有显著性差异。在相同的刺激条件下，SmadT／13一Actin4小时组和8小时组与刺激O小时组比较有显著性差异，P值分别为0．049和0．0

8、02，而其他组之间比较元显著性差异；并且Smad7总的F=3．74