《基于不同信号放大策略构建电致化学发光传感器用于生物分子的检测》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
目录摘要.................................................................................................................................IABSTRACT...................................................................................................................III第1章绪论..................................................................................................................11.1电致化学发光检测技术概述.............................................................................11.1.1电致化学发光概念...................................................................................11.1.2电致化学发光的分类..............................................................................11.2电致化学发光常用的发光物质.........................................................................31.2.1鲁米诺.......................................................................................................31.2.2联吡啶钌...................................................................................................31.2.3量子点......................................................................................................41.3不同信号放大策略用于传感器的构建.............................................................41.3.1引入纳米材料实现信号放大..................................................................41.3.2引入生物材料辅助实现信号放大..........................................................71.3.3改善发光试剂与共反应物的作用效率实现信号放大...........................91.3.4发展新型的发光物质............................................................................101.4本论文选题背景和主要工作...........................................................................12第2章基于双分子识别和聚苯胺的猝灭作用构建检测多巴胺的电致化学发光传感器....................................................................................................................................142.1前言...................................................................................................................142.2实验...................................................................................................................152.2.1试剂和化学品.........................................................................................152.2.2仪器.........................................................................................................152.2.3g-C3N4NS的合成....................................................................................162.2.4Au-g-C3N4NS和DSP/Au-g-C3N4NS的合成......................................162.2.5PANI和APBA/PANI的合成................................................................162.2.6ECL传感器的制备.................................................................................172.2.7ECL响应测试.........................................................................................172.3结果与讨论.......................................................................................................172.3.1材料的表征.............................................................................................172.3.2修饰电极的CV和ECL行为...............................................................192.3.3实验条件的优化....................................................................................212.3.4传感器对DA的ECL响应....................................................................22 2.3.5ECL传感器的选择性和稳定性.............................................................232.3.6回收实验.................................................................................................242.4结论...................................................................................................................25第3章基于原位产生和消耗共反应试剂策略构建比率型生物传感器用于次黄嘌呤的检测............................................................................................................................263.1前言..................................................................................................................263.2实验...................................................................................................................273.2.1试剂与化学品........................................................................................273.2.2仪器.........................................................................................................283.2.3rGO-CdTeQDs的制备...........................................................................283.2.4ECL生物传感器的制备.........................................................................283.2.5实验检测.................................................................................................283.3结果与讨论.......................................................................................................293.3.1材料表征.................................................................................................293.3.2生物传感器制备过程的EIS表征.........................................................293.3.3最优实验条件的选择.............................................................................303.3.4ECL传感器对Hx的响应......................................................................313.3.5ECL生物传感器的选择性和稳定性.....................................................333.3.6检测人血清样品中的Hx.......................................................................343.4结论..................................................................................................................35第4章基于CeO2@Ag纳米粒子修饰的石墨烯量子点作为信号探针的固态电化学发光传感器用于ConA的检测....................................................................................364.1前言...................................................................................................................364.2实验部分...........................................................................................................374.2.1试剂与化学品.........................................................................................374.2.2仪器.........................................................................................................374.2.3GQDs的制备..........................................................................................384.2.4制备CeO2和CeO2@AgNPs.................................................................384.2.5制备CeO2@Ag-GQDs和GOx-CeO2@Ag-GQDs................................384.2.6ECL生物传感器的构建.........................................................................394.2.7响应测试.................................................................................................394.3结果与讨论.......................................................................................................394.3.1材料的表征.............................................................................................394.3.2ECL生物传感器的电化学表征.............................................................41 4.3.3最佳实验条件选择.................................................................................434.3.4对ConA的ECL响应测试...................................................................444.3.5传感器的稳定性和选择性.....................................................................454.3.6传感器对实际样品的检测.....................................................................464.4结论...................................................................................................................46参考文献........................................................................................................................47作者相关论文题录........................................................................................................60致谢..............................................................................................................................61 摘要基于不同信号放大策略构建电致化学发光传感器用于生物分子的检测分析化学专业硕士研究生左富梅指导老师陈时洪教授摘要电致化学发光（ECL）技术因具有背景信号低、响应灵敏、仪器操作简单等优点而备受关注，目前已发展成为一种高灵敏、良好选择性的分析手段，广泛应用于食品分析、环境检测及生物研究等领域。多巴胺（DA）是一种神经递质，在人体新陈代谢、中枢神经系统和内分泌系统中起重要作用。体内正常水平的多巴胺含量能够维持人的正常运动，而极端异常的含量可能导致多种疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病等。因此，为实现早期的临床诊断，一个简单的、灵敏的检测方法是必要的。次黄嘌呤（Hx）是腺嘌呤核苷酸的一个重要代谢物。人血清和尿液中次黄嘌呤的含量能够反映人类的病理状况，如痛风和肾衰竭等。同时，Hx还是食品行业中肉类或鱼产品质量监控的指标，反映鱼类、肉类等的新鲜程度。实现快速、灵敏次黄嘌呤的检测不仅可以实现相关疾病的早期诊断，还可用于估计鱼、肉类的新鲜度。伴刀豆球蛋白A(ConA)是一种凝集素，具有与各种碳水化合物和糖蛋白结合的能力，所以常被用作蛋白质模型，实现对ConA的检测对于临床诊断和药物的开发有重要意义。基于此，本论文构建了一系列ECL传感器实现对多巴胺、次黄嘌呤以及伴刀豆球蛋白A的检测。通过纳米材料、酶催化放大、新型发光物质的选择等手段来实现对检测信号的放大，同时利用双分子识别作用、酶的特异性催化等提高对目标物检测的选择性，以实现对目标物的灵敏检测。主要工作如下：（1）基于双分子识别和聚苯胺的猝灭作用构建检测多巴胺的电致化学发光传感器类石墨型碳氮化合物（g-C3N4）是一种新型ECL发光材料，具有良好的ECL性能。我们制备了g-C3N4纳米片并用Au纳米粒子进行了改性，以提高其ECL稳定性同时实现了ECL信号的放大。将Au-g-C3N4NS复合物作为信号探针，固载于电极上，以此为基质固载识别元件二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯)（DSP)。通过多巴胺（DA）的氨基与DSP的N-羟基琥珀酰亚胺酯之间的相互作用捕获DA。接着，基于DA的邻二醇和3-氨基苯基硼酸（APBA)之间的相互作用，将3-氨基苯I 西南大学硕士学位论文基硼酸功能化的聚苯胺（APBA/PANI）捕获在电极上。由于聚苯胺对g-C3N4具有良好的猝灭作用，随着DA浓度的增加而得到逐渐减小的ECL信号。所制备的ECL传感器基于双分子识别策略和PANI对g-C3N4的ECL信号的猝灭作用，实现了对DA的高灵敏度和选择性检测。本工作利用双分子识别策略赋予了该传感器高的选择性。同时所采用的构建策略为生物小分子特异性检测提供了新的分析方法。（2）基于原位产生和消耗共反应试剂策略构建比率型生物传感器用于次黄嘌呤的检测由于比率法具有诸多的优点已经应用于对目标物的高灵敏和可靠检测。本工作以还原的氧化石墨烯-碲化镉量子点（rGO-CdTeQDs）和鲁米诺分别作为阴极和阳极发光体，酶反应的反应物（溶解O2）和生成物（H2O2）分别作为两发光体的共反应试剂以构建比率型ECL生物传感器。在Hx存在的情况下，黄嘌呤氧化酶（XOD）催化Hx并引发反应物（溶解O2）和生成物（H2O2）浓度的相反变化，从而导致两ECL信号呈现反向的变化趋势。基于比率型ECL方法的优点和酶的特异性识别，实现了对Hx的灵敏和高选择性检测。同时比率策略有效减少了检测环境干扰，提高了Hx的检测精度。发光物质CdTe量子点与鲁米诺的结合为构建比率ECL生物传感器提供了更多选择，特别是对于基于氧化酶的ECL传感系统。（3）基于CeO2@Ag纳米粒子修饰的石墨烯量子点作为信号探针的固态电化学发光传感器用于ConA的检测石墨烯量子点（GQDs）具有良好的生物相容性，低毒性，易于制备和优异的化学惰性，因而已广泛应用于各个领域。但其好的水溶性使其难以直接固载于电极上而获得固态ECL生物传感器。为了解决这个局限性，本工作以CeO2@Ag纳米粒子作为载体，利用聚酰胺（PAMAM）对其进行功能化，通过PAMAM的-NH2与GQDs的-COOH之间的相互作用将GQD链接在CeO2@AgNPs表面，以此实现了对GQDs的大量固载，同时实现了ECL信号的有效放大。使用ConA的识别元件葡萄糖氧化酶（GOx）修饰的CeO2@Ag-GQD作为ECL信号探针。以金纳米粒子修饰电极作为基底固定GOx，然后通过碳水化合物与ConA之间的特异性相互作用将ConA捕获在修饰电极上。在ConA存在下，GOx-CeO2@Ag-GQD可以连接于电极上从而实现夹心型生物传感器的构建，实现了伴刀豆蛋白A（ConA）的灵敏分析。这种构建策略提供了应用GQD建立固态ECL生物传感器的新方法。关键词：电致化学发光;生物传感器;多巴胺；次黄嘌呤；伴刀豆球蛋白AII ABSTRACTConstructionofelectrochemiluminescencesensorforbiologicalmoleculebasedondifferentsignalamplificationstrategiesAnalyticalChemistryMasterPostgraduate:FumeiZuoSupervisor:Prof.ShihongChenABSTRACTElectrochemiluminescence(ECL)isgreatlyattractiveowningtoitslowbackground,highsensitivityandsimpleoperation.Nowadays,ECLtechniquehasbecomeahighlysensitiveandselectiveanalysisapproachandappliedinvariousfields,suchasinfoodanalysis,environmentresearchandbiologicalanalysis.DAisaneurotransmitterthatplaysanimportantroleinhumanmetabolism,thecentralnervoussystem,andtheendocrinesystem.AnormallevelofDAinthebodyallowstypicalfreedomofmovement,whereasextremeabnormalitiesmaycausepituitarytumors,Alzheimer’sdisease,Parkinson’sdisease.Therefore,asimple,sensitive,low-costmethodfordetectingDAisnecessarytofacilitateaccurateandtimelyclinicaldiagnosis.Hypoxanthine(Hx)isanessentialmetaboliteofadeninenucleotide,whichismainlyaccumulatedinbiologicaltissues.TheconcentrationlevelsofHxinhumanserumandurinereflectthehumanpathologicalconditionssuchasgoutandrenalfailure.Inaddition,Hxisanindicatorforthequalitycontrolofmeatorfishproductsinfoodindustries,andreflectthefreshnessofmeatorfish.Therefore,therapidandsensitiveassayofHxisveryimportant,becauseitnotonlycanestimatefish/meatfreshnessbutalsocanrealizeearlydiagnosisofrelateddiseases.ConcanavalinA(ConA),asamemberofthelegumelectinfamily,exhibitsanabilitytobindwithvariouscarbohydratesandglycoproteins.Thus,ConAattractsmoreattentionasproteinmodel,achievingsensitivedetectionofConAissignificantforclinicaldiagnosticsanddrugdevelopment.InthisworkweconstructedECLbiosensorsachievingdetectionofDAandHxandConA,andusingnanomaterials,enzymecatalysisandfindingnewluminophoresachievingsignalsamplification.Inaddition,applyingthedualmolecularrecognitionstrategyandspecificrecognitionofenzymeimprovedtheselectivityofthebiosensor,thusachievingsensitivedetectionoftargetmoleculesIII 西南大学硕士学位论文Thisthesisincludesthefollowingthreeparts:（1）AnElectrochemiluminescentSensorforDopamineDetectionBasedonaDual-MoleculeRecognitionStrategyandPolyanilineQuenchingGraphite-likecarbonnitride(g-C3N4)wasakindofnovelECLluminescencewithexcellentECLperformance.Inourwork,wepreparedg-C3N4nanosheetandmodifiedwithAunanoparticlestoimproveitsECLstabilityachievinganamplificationofECLsignals.ThenAu-g-C3N4NSwereservedassignalprobesandasamatrixtoimmobilizerecognitionelementdithiobis-(succinimidylpropionate)(DSP),capturingdopamine(DA)bytheinteractionbetweentheaminogroupofDAandtheN-hydroxysuccinimideesterofDSP.Next,3-aminophenylboronicacidfunctionalizedPANI(APBA/PANI)wasincubatedontotheelectrodebasedontheinteractionbetweenthediolofDAandtheboronicacidofAPBA.PANIcouldefficientlyquenchtheECLintensityofg-C3N4,thuswithincreasingofDAconcentrationsareducedECLsignalswereobtained.ThepreparedECLsensorachievedhighlysensitiveandselectivedetectionofDAbasedondual-molecularrecognitionstrategyandthequenchingeffectofPANIontheECLemissionofg-C3N4.Furthermore,thedual-molecularrecognitionstrategyendowedthesensorwithhighselectivity.Theconstructionstrategydescribedhereprovidesanewanalyticalmethodforthespecificdetectionofsmallbiomolecules.（2）AsensitiveratiometricelectrochemiluminescencebiosensorforhypoxanthinedetectionbyinsitugenerationandconsumptionofcoreactantsRatiometricapproachhasbeenusedforsensitivedetectionoftargetsinanalyticalchemistrybecauseofitsadvantages.Inourwork,wechosethereducedgrapheneoxide-CdTequantumdots(rGO-CdTeQDs)andluminolasthecathodicandanodicemitterstoconstructanratiometricECLbiosensor.Andintheprocessofexperiments,thereactant(dissolvedO2)andtheproduct(H2O2)inenzymaticreactionservedascoreactantsoftwoluminescences,respectively.InthepresenceofHx,thexanthineoxidase(XOD)wouldcatalyzehypoxanthine(Hx)andtriggeredanoppositechangesintheconcentrationofthereactantandtheproduct,thusresultinginareversechangetrendintwoECLsignals.BasedontheadvantagesofratiometricECLapproachandspecificrecognitionofenzyme,wesuccessfullyachievedsensitiveandhighlyselectivedetectionofHx.SuchaconstructionstrategydecreasedtheinterferencefromenvironmentandimprovedthedetectionaccuracyofHx.TheintegrationofCdTeQDsIV ABSTRACTandluminolprovidesmorechoiceforconstructingratiometricECLbiosensors,especiallyforoxidase-basedECLsensingsystem.（3）Asolid-stateelectrochemiluminescencebiosensorforConAdetectionbasedonCeO2@AgnanoparticlesmodifiedgraphenequantumdotsassignalprobeGraphenequantumdots(GQDs)possessperformanceofgoodbio-compatibility,lowtoxicity,easypreparationandexcellentchemicalinertness.Therefore,ithasbeenappliedinvariousfields,butitswatersolublemakeitdifficulttodirectlyapplytoestablishthesolid-stateECLbiosensor.Tosolvethislimitation,wesynthesizedtheCeO2@AgNPsascarriesandfunctionalizedbypolyamidoamine(PAMAM)achievingloadingofGQDsbyinteractionbetweenthe-NH2ofPAMAMandthe-COOHofGQDs,thusobtainedanamplificationofECLsignals.Usingglucoseoxidase(GOx)funcituonalizedCeO2@Ag-GQDs(GOx-CeO2@Ag-GQDs)asECLsignalprobes,thegoldnanoparticles(AuNPs)modifiedelectrodewereusedasmatrixtoimmobilizeGOx,whichcouldcaptureConAbythespecificinteractionbetweencarbohydrateandConA.inpresenceofConA,GOx-CeO2@Ag-GQDwerecapturedonelectrodeformingasolid-statebiosensorachievingsensitiveanalysisofConA.SuchaconstructionstrategyprovidesanewapproachforapplyingGQDstoestablishasolid-stateECLbiosensor.Keywords:ECL;Biosensor;Dopamine;Hypoxanthine;ConcanavalinAV 第1章绪论第1章绪论1.1电致化学发光检测技术概述1.1.1电致化学发光概念电致化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）也称为电化学发光，是指当对含有电致化学发光活性物质的体系施加一定的电压或通过一定的电流时，发光物质在电极表面发生电化学及化学反应后，形成高能的激发态，再经弛豫而产生光的现象。电致化学发光技术是将电化学方法和化学发光方法相结合的一种分析检测技术，因此它具有电化学和化学发光两种方法的优点，例如灵敏度高、背景信号低、可控性和选择性好、仪器操作简便、分析速度快、应用范围广等[1-3]。由于电致化学发光检测技术的诸多优点，近年来在生命科学、医学、分析检测等领域被广泛应用[4-8]。电致化学发光现象最早是在1927年由Dufford等人发现，他们对格林试剂（Grignard）的无水乙醚溶液的阳极或阴极施加500V到1500V电压时产生电解发光现象[9]。随后，Harvey等人在2.8V电压下，阳极电解碱性溶液时产生发光氨[10]。从此科学家们开启了对电致化学发光的探究之路。20世纪60年代，Kuwana等人[11]再次深入研究电致化学发光现象，并率先探究了鲁米诺在铂电极上的电化学发光行为及其发光机理。之后一些稠环芳烃如芘类化合物、红荧烯、吲哚类、蒽以及他们的衍生物等的电致化学发光现象被相继发现并在各领域得到应用[12,13]。1.1.2电致化学发光的分类电致化学发光现象的发生一般经历电化学反应和化学发光两个过程。电化学反应提供发生化学发光反应的所需的中间体；随后中间体与中间体之间或中间体与溶液中其他物质间发生化学反应，使发光物质被激发而产生激发态，当激发态物质返回基态时发光。电致化学发光根据其发光过程的电位控制方法以及参与发光反应的物质种类可以分为以下两类：湮灭型电致化学发光（AnnihilationECL）和共反应物参与型电致化学发光（CoreactantECL）。湮灭型：是指在电极表面施加一交变电压，使在电极表面形成发光物质的氧化态自由基和还原态自由基，氧化态自由基和还原态自由基发生湮灭反应后形成发光物质的激发态，再经弛豫后发光，如Ru(bpy)2+3的电致化学发光现象。在对Ru(bpy)2+2+3体系施加正负双阶跃脉冲电压后，Ru(bpy)3在电极表面经过氧化和还原过程分别生成Ru(bpy)3++3和Ru(bpy)3两种中间体。这两种中间体能够直接发生湮灭反应而生成激发态的Ru(bpy)2+2+3*，在Ru(bpy)3*返回基态时产生电致化学发光现1 西南大学硕士学位论文象，具体过程如下所示[14]：共反应物参与型：是指发光物质与共反应试剂同时发生氧化或还原，共反应物会迅速分解产生高能态自由基中间体，发光物质与该自由基发生反应并形成激发态，再经弛豫而发光。如三丙基胺(TPrA)-联吡啶钌体系的电致化学发光。Ru(bpy)2+[15]3以TPrA为共反应物的电致化学发光机理主要有以下几种形式：(A)在电极表面发光物质和共反应物质被氧化产生Ru(bpy)3+·+3和TPrA，然后Ru(bpy)3+·+·3与TPrA去质子化后形成的中间体TPrA发生反应并生成激发态的Ru(bpy)2+2+3*，Ru(bpy)3*跃迁回基态时产生发光；(B)在电极表面发光物质和共反应试剂同时被氧化产生Ru(bpy)3+·+3和TPrA，TPrA·+去质子化后得到TPrA·并与Ru(bpy)2++2+3反应生成Ru(bpy)3。随后Ru(bpy)3与Ru(bpy)+2+*，在其返回基态时发光；3发生反应产生激发态的Ru(bpy)3(C)共反应试剂先在电极表面被氧化生成TPrA·+，去质子化后得到中间体TPrA·并与发光物质Ru(bpy)2++3直接发生反应生成Ru(bpy)3。所生成的发光物质的·+2+*。激发态的Ru(bpy)2+中间体继而和TPrA相互作用生成激发态的Ru(bpy)33*跃迁回基态时发光。以上过程如图1.1所示：图1.1Ru(bpy)2+3/TPA激发态的形成和发光原理Fig.1.1Ru(bpy)2+3/TPAECLexcitedstateformationandlightemission.Copyright2002ACS2 第1章绪论1.2电致化学发光常用的发光物质发光材料是电致化学发光检测技术的基础，其响应信号直接影响该技术分析检测的灵敏度和检测结果的准确性。随着电致化学发光检测技术的不断发展，对发光物质的研究也逐渐深入。典型的ECL发光物质主要以有机体系的鲁米诺（luminol）及其衍生物，无机体系的联吡啶钌及其衍生物，以及半导体量子点为代表的量子点体系为主。1.2.1鲁米诺鲁米诺（Luminol）是一种人工合成的有机化合物，又名发光氨，在1929年时由Harvey发现其发光现象。目前已有许多关于鲁米诺电化学发光行为的研究工作，并提出其氧化发光和还原发光的机理[16]。与传统的自由基湮灭或共反应剂参与机理不同的是鲁米诺自身可以在电极上被电氧化而发光，其发光体系中不涉及氧化态和还原态物种。而且鲁米诺在电极表面的电氧化过程是不可逆的。通常鲁米诺以H2O2为共反应试剂以增强其发光效率，Luminol-H2O2体系的电致化学发光机理如图1.2所示：图1.2Luminol-H2O2体系的电致化学发光机理Fig.1.2Proposedmechanismsofluminol-H2O2ECLsystem.Copyright1982ElsevierLuminol-H2O2体系具有量子产率高、化学性质稳定等优点，因而在生物分析领域应用广泛。1.2.2联吡啶钌Ru(bpy)2+[17]3是具有八面体空间构型、中心离子配位数为6的配合物，它的电致化学发光现象由Hercules等人在1966年发现[18]。Ru(bpy)2+3具有高的发光效率，良好的水溶性，以及强的化学稳定性，激发态寿命长等优点。且Ru(bpy)2+3在电极3 西南大学硕士学位论文表面发生的氧化还原是可逆的，可以循环利用，因而它是目前电致化学发光领域中应用最为广泛的发光物质。1.2.3量子点量子点一般是指基于Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族以及Ⅳ-VI三个系列的纳米晶体材料，由于存在量子限域效应而具有特殊的光学和电子学性质。石墨烯量子点（GQDs）是一种单原子厚度的尺寸小于10纳米的石墨烯片[19]。较传统的半导体量子点而言，石墨烯量子点具有更优越的性质，如无毒、易制备等。与其他的石墨烯纳米片相似，石墨烯量子点具有大的比表面积、高导电性、高导热性、优异的溶解性，以及高的光学稳定性、良好的生物相容性等，因此在光电设备、生物成像、生物传感、药物运输等方面有良好的应用前景[20,21]。石墨烯量子点作为一种新的碳材料在电致化学发光领域已有研究，常见的以S2-2O8作为共反应剂的阴极电致化学发光机理如下：GQDsnenGQDs2-2S2O8eSO4SO42GQDsSO4GQDsSO4GQDsGQDshv1.3不同信号放大策略用于传感器的构建分析检测中，有效的信号放大是提高检测灵敏度的一个关键手段。因此在分析检测过程中通常会选择不同方法来实现对检测信号的有效放大而提高检测的灵敏度。在近几年的电致化学发光生物传感器构建中，主要利用以下几种方法实现响应信号的放大。1.3.1引入纳米材料实现信号放大纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围内（1~100nm）或由它们作为基本单位构成的材料，如碳基纳米材料、金属纳米粒子、量子点、以及聚合纳米材料等。纳米材料的特殊结构使其拥有独特的物理化学性质：大的比表面积，良好的化学稳定性、生物相容性，优异的催化、导电性能。在实验中引入纳米材料可以有效提升传感器的检测性能。一般纳米材料主要通过四种方式实现对信号的放大：一是利用纳米材料具有优越的导电性或良好的生物相容性，将其引入传感器中以降低反应能垒，增强响应信号；二是利用纳米材料的大比表面积增加发光物质（信号物质）的固载量从而放大信号；三是利用纳米材料的仿酶（模拟酶）性质实现对检测信号的有效放大；四是利用纳米材料自身催化活性及4 第1章绪论导电性促进电子传递速率，进而增强检测信号。例如，Ju课题组基于石墨烯纳米材料良好的生物相容性、易功能化的性质，构建了灵敏检测DNA特定位点和酶活性的传感器。如图1.3所示，首先利用单层氧化石墨烯负载大量的硫瑾，通过氧化石墨烯与DNA链的相互作用结合到DNA单链的3’端，从而得到强的电化学信号实现检测[22]。图1.3基于GO和限制性核酸内切酶信号放大实现基因特异性DNA甲基化检测和甲基转移酶活性检测示意图Fig.1.3Schematicillustrationoftheproceduresofthegene-specificDNAmethylationdetectionandmethyltransferaseactivityassaybasedontheelectrochemicalsignalamplificationofGOandrestrictionendonuclease.Copyright2012ACSLi课题组利用氧化石墨烯纳米材料与碲化镉量子点（CdTeQDs）相结合构建了传感器[23]。由于氧化石墨烯的优良的导电性加速CdTeQDs·+的生成并引发检测体系中O·－·+·－2形成，当CdTeQDs和O2相互反应时形成大量的激发态CdTeQDs*，从而有效增强了量子点的电致化学发光强度，实现对检测信号的放大。Zhou等人[24]以鲁米诺为还原剂还原氯金酸继而还原氯铂酸形成花状的复合物即Pt@AuNPs，该复合物具有大的比表面积和良好的催化活性。如图1.4所示，以Pt@AuNPs作为载体固载了大量的发光物质鲁米诺，同时结合了胆固醇氧化酶和二抗蛋白制得夹心型的ECL免疫传感器，实现了心肌肌钙蛋白的检测。复合物Pt@AuNPs具有仿辣根过氧化物酶活性，它能够催化氧化由胆碱氧化酶与底液胆碱反应的产物过氧化氢的分解，进而有效的促进鲁米诺的电致化学发光信号，实现了对发光物质信号的有效放大。5 西南大学硕士学位论文图1.4Ab2/luminol-Pt@AuNFs/ChOx的制备过程以及ECL生物传感的构建示意图Fig.1.4TheschematicdiagramsofthepreparationofAb2/luminol–Pt@AuNFs/ChOxprobes(Ab2bioconjugates),andtheconstructionofECLbiosensorforcTnI.Copyright2014RSC二氧化硅纳米材料具有大的比表面积[25]，Chen等人利用二氧化硅封装钌复合物，然后在其表面组装金纳米粒子增加比表面积并增强电子转移能力。伴刀豆蛋白A（ConA）具有良好的生物相容性，将其修饰在金纳米粒子的表面作为细胞表面的识别原件，通过与甘露糖和细胞表面的N-聚糖的三甘露糖苷的特异亲和力将ConA@Au-RuSiO2NPs与细胞表面相结合，因而细胞表面的甘露糖和N-聚糖的表达能够通过钌的ECL信号来显示。该传感器的构建示意图如图1.5所示。经金纳米粒子修饰的钌复合物的生物兼容性、电致化学发光强度都得到有效提高，以此构建的生物传感器对K562细胞表现出优异的分析性能。图1.5基于ConA的ECL生物传感器动态评估的细胞表面N-聚糖表达的示意图Fig.1.5SchematicillustrationofECLbiosensorfordynamicevaluationofcellsurfaceN-glycanexpressionbasedonConA.Copyright2013ACS6 第1章绪论1.3.2引入生物材料辅助实现信号放大引入酶催化、DNA扩增手段等实现信号放大是生物传感器中应用较为广泛的一种方法。酶是一种具有生理调节功能的蛋白质，参与生物体内代谢及转换反应。酶具有专一性，对特定的底物有高效的催化作用。在生物分析中酶通常作为标记物间接指示目标分子浓度，或与纳米材料联用提高固载量及催化效率。过硫酸根作为发光试剂的电致化学发光机理已经被研究：S2-2O8在电极上获得电子转换为SO·－2-·－4和SO4，SO4随后和水溶液相互作用产生激发态的高能氧分子，该高能氧分子返回基态时发光。增加检测液中溶解氧的含量能够有效提高S2-2O8/O2体系的ECL强度。据此Wang等人[26]结合辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶两种酶的协同作用，催化底液中的葡萄糖原位产生O2，通过提高电极表面O2的含量来增强S2-2O8的电致化学发光信号，从而构建传感器实现对甲胎蛋白的灵敏检测.Fan等人基于金纳米粒子包裹的PtNi纳米立方构建生物传感器，实现ConA的灵敏检测。将葡萄糖氧化酶负载在PtNi立方表面，葡萄糖氧化酶催化氧化底液中的葡萄糖产生过氧化氢，具有催化活性的PtNi纳米立方同时催化过氧化氢在电极表面原位生成O2，当电极表面的溶解氧含量增加时得到增强的ECL信号，从而实现对ConA的灵敏检测，检测限低至0.0002ng/mL[27]。其传感器构建如图1.6所示。图1.6GOD-AuNPs-TSC-PtNiNCs合成过程（A）及ECL传感器的构建过程（B）示意图Fig.1.6Theillustrationofthesyntheticprocessof(A)GOD-AuNPs-TSC-PtNiNCsand(B)thepreparationoftheECLbiosensor.Copyright2017Elsevier滚环扩增技术（rollingcircleamplification，RCA）是一种以病原生物体滚环复制为模型，在恒温条件下以环状DNA为模板，以短的单链DNA为引物实现核酸快速复制的技术。RCA具有操作简单、快速、高效等特点，在临床及微生物分子7 西南大学硕士学位论文诊断中应用较多。Cheng等人[28]采用滚环扩增技术，构建了检测血管内皮生长因子的夹心型免疫传感器。如图1.7所示，在二抗上标记生物素，利用与亲和素的相互作用结合生物素标记的引物。在模板DNA及原料脱氧核苷三磷酸存在的情况下发生RCA反应，产生长的单链并与大量修饰量子点的短DNA链互补，进而得到放大的电化学信号实现对血管内皮生长因子的高灵敏检测。图1.7用于蛋白质检测的级联信号放大策略示意图Fig.1.7SchematicRepresentationoftheCascadeSignalAmplificationStrategyforProteinDetection.Copyright2010ACS图1.8基于DNA四面体树枝状分子固载指示剂以及催化自组装目标循环信号放大策略构建ECL适体传感器用于LPS的检测示意图Fig.1.8FabricationprocessoftheECLaptasensorforLPSdeterminationbasedonDNAtetrahedrondendrimersfortheECLindicatorsbindingandCHAtargetrecyclingstrategyforsignalamplification.Copyright2016ACS自组装是指一定的基本单元结构如分子、纳米粒子、生物大分子等在一定条件下靠分子间氢键作用、范德华力、静电相互作用、π-π堆积等相互作用力自发的8 第1章绪论形成稳定的、有序的结构的过程。DNA自组装是一种遵循碱基互补配对原则按一定顺序自发组装的技术，通过合理设计碱基序列可以实现对DNA纳米结构的控制，从而用于传感器的构建实现信号放大。如Xie等人[29]利用DNA自组装技术将四条DNA单链自组装形成DNA四面体树枝状结构，该结构中包含较多双链，为多柔比星提供了大量的嵌入位点，从而将链接发光物质ABEI（N-(氨基丁基)-N-(乙基异鲁米诺)）的多柔比星结合在树枝状结构上，通过提高发光物质的固载量而实现ECL信号的放大以及目标物的灵敏检测。DNA自组装过程以及传感器构建如图1.8所示。杂交链式反应（hybridizationchainreaction，HCR）是一种链置换驱动的DNA自组装技术，它是通过一段单链寡核苷酸引发两条含有粘性末端的发夹型单体交叠杂交成一段带有缺口的双链DNA结构。HCR可以在恒温无酶的条件下发生，且特异性高、操作简单，通过设计可以得到带有功能化侧链的双链DNA结构而实现对检测信号放大的目的。Chen等[30]通过目标DNA引发杂交链式反应在电极上组装了大量的无限延伸的DNA双链结构。该双链结构含有丰富的嵌入位点可使钌复合物（Ru(phen)2+3）嵌入双链中从而固载到电极上，有效提高了发光物质的负载量得到增强的电致化学发光信号。1.3.3改善发光试剂与共反应物的作用效率实现信号放大电致化学发光检测技术在发展初期都是将发光试剂或共反应试剂置于检测底液中。随着对电致化学发光技术的深入研究，研究者将发光物质（或发光试剂与共反应剂）固载到电极上以提高发光效率，同时避免了发光试剂的浪费，也减少了因发光试剂挥发性、溶解性等引起的实验操作误差。例如Zhuo等人[31]将PEI树枝状大分子与发光物质钌通过戊二醛作用相结合，并通过π-π堆积作用负载到碳纳米管上作为信号探针构建了ECL传感器（如图1.9)。PEI大分子富含大量的氨基（伯仲叔胺）可作为钌的共反应剂，将共反应剂与发光物质链接并固载到电极上，减小了分子间的距离以提高钌的发光效率。另外，碳纳米管可用于大量负载发光复合物进一步实现信号增强。然后在电极上沉积金纳米粒子结合二抗复合物，通过目标抗原与抗体间的亲和作用将信号探针结合在电极上实现对APE-1（嘌呤/嘧啶核酸内切酶1）的灵敏检测。9 西南大学硕士学位论文图1.9Ab2/HGNPs/PTCA-PEI-Ru(II)/CNTs的制备（A）及ECL传感器构建过程（B）示意图Fig.1.9Schematicillustrationof(A)Ab2/HGNPs/PTCA-PEI-Ru(II)/CNTsprobe(Ab2bioconjugates)fabricationand(B)ECLimmunosensorpreparationprocess.Copyright2014ACSWang等人[32]设计合成了自增强型的分子，即在该分子中同时含有发光基团和共反应分子。将原本是发光试剂与共反应试剂两个分子间的相互作用转换为一个分子内的两个不同基团间的相互作用，缩短了两者间作用距离，减少了能量损失,从而提高了共反应剂的作用效率，实现了对发光物质ECL信号的有效增强。自增强分子的设计及传感器构建过程如图1.10所示.图1.10原子转移自由基聚合反应的过程以及ECL免疫传感器的制备和反应机理示意图Fig.1.10ThedetailedreactionprocessoftheatomtransferradicalpolymerizationreactionandtheschematicdiagramofthepreparationandreactionmechanismoftheECLimmunosensor.Copyright2014RSC1.3.4发展新型的发光物质发光试剂及其对应的共反应试剂是研究电致化学发光技术的重点，因此对新型发光试剂的探索并未止步。近年来，新型的发光物质类石墨烯型氮化碳、有机荧光染料、金属纳米簇及碳点等的研究也备受关注。半导体纳米材料类石墨烯型氮化碳（g-C3N4）是一种新型的非金属半导体材料，其分子内的氮原子和碳原子间通过sp2杂化方式以σ键连接成类似苯环的六边形结10 第1章绪论构。且每个碳原子和氮原子的剩余单电子的p轨道相互作用，键合形成大的π共轭平面，因而g-C3N4具有高的化学稳定性、良好的热稳定性等优点。自2012年Cheng等人[5]研究了g-C3N4的电致化学发光行为以来，因其成膜性好、无毒、易功能化等性质而被广泛关注。然而，Chen等人[33]在实验中发现g-C3N4纳米片的电化学发光稳定性随着施加电压的增加而显著降低;当扫描电位超过-0.9V时会产生电极钝化现象，从而阻断后续的ECL发射，这一现象阻碍了以g-C3N4纳米片为发光物质的电致化学发光传感器的研究进程。随后Chen等人通过在g-C3N4表面修饰的金属纳米粒子减少过多高能电子注入g-C3N4以提高其稳定性，并改善发光性能。以K2S2O8为共反应试剂时，Au-g-C3N4材料修饰的电极显示出强的ECL信号，直接固载抗体识别抗原即制得灵敏检测癌胚抗原CEA的传感器。9，9-二辛基聚芴（PFO）是一种有机染料。早在2001年，Prieto及其课题组就研究了PFO在苯-乙腈溶液中的电致化学发光行为，并探究了其发光的湮灭机理[34]。但PFO难溶于水，且其溶剂苯-乙腈对生物体具有一定的毒性，使得它的应用受到较大限制。为解决这一问题，Wu等人通过相转移方法制得系列共轭聚合物点[35]，之后Lu等人[36]据此合成了水溶性的PFO并探究了其电致化学发光性能。在以草酸钠为共反应试剂时，PFO具有强的电致化学发光响应，其反应机理如图1.11所示。基于三聚氰胺对PFO-C2-2O4体系的猝灭作用，实现了传感器对三聚氰胺的灵敏检测。图1.11以草酸为共反应试剂的PFO的ECL反应机理Fig.1.11DiagramoftheECLmechanismofPFO.Copyright2015RSCBODIPY（硼-二吡咯亚甲基）是一种荧光染料，以其独特的小斯托克斯位移、高的荧光量子产率而著称。Bard课题组开创了几种在水溶液、有机溶剂、乳液介质中的BODIPY并探究了其电化学及电致化学发光性质[37-40]。他们发现BODIPY的电致化学发光效率并不如预想那样高，而且在几种情况下，它的电化学特征与它的结构有直接的关系。于是，Ding等人[41]设计了具有大分子结构的BODIPY染料，使其具有化学和电化学稳定性，以及高的荧光量子产率、好的电化学发光效11 西南大学硕士学位论文率。同时将PbS纳米簇与BODIPY封端配体组成杂化体，在以三丙胺为共反应剂作用下产生强的电致化学发光信号，其ECL机理如图1.12所示。该PbS-BODIPY系统在生物成像、分析检测等领域有极大的应用潜能。图1.12PbS-BDY纳米晶体在TPrA存在条件下的ECL机理Fig.1.12ECLmechanismsofPbS-BDYnanocrystalsinthepresenceofTPrA.Copyright2015ACS1.4本论文选题背景和主要工作检测与人类疾病相关的生物分子/生物标志物对疾病的早期监测、诊断及对相关药物的研究具有重要意义。例如，神经递质——多巴胺，它在人体新陈代谢、中枢神经系统和内分泌系统中起重要作用。体内正常水平的多巴胺含量能够维持人的正常运动，而极端异常的含量可能导致多种疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病等[42]。次黄嘌呤是腺嘌呤核苷酸的一个重要代谢物。人血清和尿液中次黄嘌呤的含量能够反映人类的病理状况，如痛风和肾衰竭等[43]。另外，Hx也是食品行业中肉类或鱼产品质量监控的指标，其含量能够反映鱼类、肉类等的新鲜程度。伴刀豆球蛋白A是一种生物凝集素，它具有与各种碳水化合物和糖蛋白结合的能力，因而常被用作蛋白质模型或生物标记物，用于临床诊断和药物的开发等领域。因此，构建选择性好、灵敏度高、分析快、操作简单的检测方法对实现人类病理相关的生物分子的检测，可以实现对相关疾病的监控或早期诊断，同时对临床研究和药物开发有重要意义。因此，本论文为实现对多巴胺、次黄嘌呤及伴刀豆球蛋白A的灵敏检测，构建了一系列ECL生物传感器，通过纳米材料固载、酶催化放大、新型发光物质的选择等手段来实现传感器的信号放大，同时利用双分子识别作用、酶的特异性催化等提高对目标物检测的选择性，以此实现对目标物的灵敏检测。主要包含以下几方面的内容：（1）通过化学超声剥离的方法从块状的g-C3N4上剥离出片层的g-C3N4，并用Au纳米粒子进行改性以增强其发光效率。再在其表面组装DSP分子并暴露出氨基反应性残基，可用于目标物多巴胺的识别。以Au-g-C3N4-DSP为基底材料和12 第1章绪论信号探针，将其孵育在电极上，基于聚苯胺对g-C3N4的猝灭作用构建夹心型的双分子识别的生物传感器，用于多巴胺的灵敏检测。（2）合成还原氧化石墨烯-碲化镉量子点（rGO-CdTeQDs），通过还原氧化石墨烯增强量子点的成膜性同时提高其发光效率。并以该复合物与鲁米诺分别作为传感器的阴极和阳极信号物质。在电极表面孵育黄嘌呤氧化酶，通过酶反应的发生消耗rGO-CdTe的共反应试剂（溶解氧），同时生成鲁米诺的共反应试剂（过氧化氢），从而引起两种发光信号强度的相反变化。以此方法构建比率型ECL传感器用于次黄嘌呤的灵敏检测。利用酶催化反应实现信号放大以提高检测灵敏度。（3）合成了无毒、生物相容性好的石墨烯量子点，以CeO2@Ag纳米复合物为载体实现了水溶性石墨烯量子点在电极上的固载，同时增加了固载量提高传感器的响应信号。通过电沉积作用，在电极表面修饰金纳米粒子以固定目标识别原件，以CeO2@Ag-GQDs为信号探针，在过硫酸根为共反应试剂条件下探究了其ECL响应性能，并以此构建了夹心型的生物传感器，实现对生物标志物ConA的选择性检测。13 西南大学硕士学位论文第2章基于双分子识别和聚苯胺的猝灭作用构建检测多巴胺的电致化学发光传感器2.1前言电化学发光检测技术由于其检测成本低，背景信号低，灵敏度高等优点，在临床诊断、环境检测和食品分析以及免疫分析中得到了广泛的应用[44]。在ECL体系中，钌复合物(Ru(Ⅱ))[45]，鲁米诺[46]，金纳米团簇[47]和CdS、CdSe、CdTe、PbSe等半导体量子点[3,48-50]作为ECL发光体被广泛应用。半导体材料中g-C3N4因其结构特殊、合成成本低、荧光量子产率高、ECL发射强等特点引起了人们的广泛关注[51-53]。g-C3N4纳米材料，如片状的g-C3N4（g-C3N4NS）表现出优异的溶解性以及高的比表面积。此外，g-C3N4NS易与其他功能材料，如金纳米粒子（AuNPs）[54]和非金属材料等结合[55]。为扩大g-C3N4在ECL检测中的应用范围，研究了几种g-C3N4的ECL猝灭剂。例如，金属有机化合物二茂铁，它能够通过电子转移和能量转移有效地淬灭g-C3N4的ECL[56]；芦丁可做g-C[57]3N4ECL的淬灭剂，从而实现对芦丁的检测；另外金属离子也可作为g-C2+3N4的猝灭剂，例如Cheng等人基于Cu对g-C3N4的ECL信号的猝灭作用，实现了Cu2+的灵敏检测[58]。聚苯胺（PANI）是一种具有优异的导电性、良好的生物相容性和稳定性的聚合材料，无毒且具有较大的比表面积[59,60]，因而被广泛应用于传感器。然而，关于PANI作为ECL猝灭剂的报道却很少。在我们以前的研究中发现PANI能够抑制g-C[61]3N4的ECL的发射，该现象表明PANI可作为猝灭剂用于ECL传感的构建。多巴胺（DA）是一种在人体新陈代谢、中枢神经系统和内分泌系统中起到重要作用的神经递质[62]。体内正常水平的多巴胺含量能够维持人的正常运动，而极端异常的含量可能导致垂体瘤、阿尔茨海默病、图雷特综合征、帕金森病和精神分裂症等[63]。因此，为实现早期的临床诊断以及提高检测准确度，提出一个简单的、灵敏的、低成本的检测方法是必要的。目前用于定量测定DA的方法包括高效液相色谱-质谱[64]、比色法检测[65]、电化学方法[66]和ECL方法等。但在检测多巴胺时易受到其他邻苯二酚衍生物和有氨基化合物的干扰，导致选择性较低。幸运的是，这个障碍可以用双分子识别策略解决。所谓的双分子识别即目标分子的不同位点能够依次被两个分子识别[67]。在本工作中，利用DA的氨基和3,3'-二硫代二丙酸二（N-羟基琥珀酰亚胺酯）（DSP）的N-羟基琥珀酰亚胺酯，以及DA的邻二醇和三氨基苯硼酸-聚苯胺复合物（APBA/PANI）的硼酸之间相互作用实现对DA检测的双分子识别，从而构建14 第2章基于双分子识别和聚苯胺的猝灭作用构建检测多巴胺的电致化学发光传感器夹心结构的ECL传感器。以Au-g-C3N4NS纳米复合材料作为基底材料，负载识别元件DSP，因为DSP能够断裂二硫键与Au纳米粒子形成Au-S键[68]。通过DSP所暴露的胺反应性琥珀酰亚胺残基来捕获DA。然后，DA的邻二醇和APBA的硼酸之间的化学识别作用能够将APBA/PANI孵育到电极上。随着在电极上孵育的DA量的增加，捕获到的APBA/PANI也越多，因而ECL信号强度随之减小。基于PANI对g-C3N4ECL信号的良好猝灭作用，实现了对DA高灵敏度、高选择性的检测。本工作所提出的构建传感器的策略为检测小分子提供了有前景的检测平台。图2.1ECL传感器的制备及复合材料的合成示意图Fig.2.1SchematicdiagramsofthemethodsusedtopreparetheECLsensorandDSP/Au-g-C3N4NScomposite2.2实验2.2.1试剂和化学品三聚氰胺（2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪，99%）购自阿拉丁有限公司（中国上海）；多巴胺、苯胺和氯化金四水合物（HAuCl4·4H2O）由SigmaChemicalCo.（St.Louis，MO，USA）购得；DSP购自Heowns（中国天津）。过硫酸钾（K2S2O8），三氨基苯硼酸购自上海化学试剂公司（中国上海）；使用KH2PO4（0.10mol/L）和NaHPO（40.10mol/L）制备各种pH值的磷酸盐缓冲（PBS）溶液，并使用0.10mol/L的KCl作为支持电解质。2.2.2仪器使用MPI-A型电化学发光分析仪（西安雷马克斯电子科技有限公司，中国西安）进行ECL检测；采用CHI600D电化学工作站（上海辰华仪器有限公司），在3.0mL5.0mmol/L[Fe(CN)3-/4-6]中进行循环伏安法（CV）测定；使用透射电子15 西南大学硕士学位论文显微镜（TEM，JEM-1200EX）和扫描电子显微镜（SEM，S-4800，日本）分析各种纳米材料的形貌和尺寸；利用X射线光电子能谱（XPS，USA）分析各种纳米材料的组成。使用UV-2450UV-vis分光光度计（Shimadzu，Tokyo，Japan）获得UV-可见光（UV-vis）吸收光谱；使用FT-IR分光光度计（NicoletInstrument）进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）检测。2.2.3g-C3N4NS的合成利用三聚氰胺在高温条件下聚合形成g-C[69]3N4。首先，称取15g三聚氰胺加入氧化铝坩埚中，在马弗炉中600℃条件下加热2h，升温速率为5℃/min。冷却取出后得到块状的g-C3N4。再将0.20g的块状g-C3N4分散在200mL去离子水中并超声处理12h，然后过滤除去未剥离的g-C3N4。最后，将悬浮液在空气中干燥即得到片层的g-C3N4。2.2.4Au-g-C3N4NS和DSP/Au-g-C3N4NS的合成首先，将1.0mgg-C3N4NS分散在1mL去离子水中。接着，在搅拌条件下将10µLHAuCl4溶液（1%）加入到g-C3N4NS分散液中，持续搅拌6h。再将25μL的NaBH4溶液（0.010mol/L）加入到g-C3N4NS混合物中，搅拌20min以还原AuCl-4。然后向混合物中滴加10μL柠檬酸钠溶液（0.010mol/L），搅拌30min用以提高Au-g-C[33]3N4NS的稳定性。因为随着柠檬酸钠的添加，柠檬酸盐可被氧化成丙酮羧酸盐，与金纳米粒子螯合使得金纳米粒子表面间羧基的静电排斥作用阻碍金纳米粒子的团聚。接下来，将Au-g-C3N4NS以9000rpm离心10min，并用去离子水洗涤几次。最后，将收集的沉淀再分散在1mL去离子水中。为了制备DSP/Au-g-C3N4NS复合物，将50μLDSP（2.0mmol/L）加入到1.0mL制备的Au-g-C3N4NS分散液中，然后超声处理30min后再搅拌4h使反应完全。然后，将混合物离心，并用丙酮洗涤和去离子水洗涤三次。最后，将沉淀再分散在1mL去离子水中。图2.1显示了DSP/Au-g-C3N4NS的合成过程。DSP通过断裂分子中的二硫键，在AuNP和DSP之间形成Au-S键以组装在Au-g-C3N4NS表面上，同时暴露出胺基反应性琥珀酰亚胺残基，与DA的胺反应[70]。2.2.5PANI和APBA/PANI的合成根据已有文献合成PANI[71]。首先，将0.91g(NH4)2S2O8溶于4mLHCl溶液（1.0mol/L）中，将184μL苯胺溶于4mL1.0mol/LHCl溶液中，并在0℃超声10min。接下来，将制备好的(NH4)2S2O8溶液滴加到苯胺溶液中，然后加入250μL乙醇，混合物在4℃搅拌12h以上。最后，将得到的墨绿色的PANI沉淀离心并用去离子16 第2章基于双分子识别和聚苯胺的猝灭作用构建检测多巴胺的电致化学发光传感器水洗涤几次。最后将沉淀物在4℃条件下储存备用。为制备APBA/PANI，将10mgPANI沉淀加入到1.0mLAPBA（0.010mol/L）中，然后将混合物搅拌24h。APBA通过π-π堆积作用获得APBA/PANI复合物，离心洗涤后，分散于1.0mL去离子水中备用。2.2.6ECL传感器的制备玻璃碳电极（GCE，Φ=4mm）分别用0.3µm和0.05µm氧化铝粉抛光，并用去离子水和乙醇超声处理几次，以获得镜面状表面。接下来，将10μLDSP/Au-g-C3N4NS的分散液滴在洁净的GCE的表面上，并在室温下干燥。随后，将20μL不同浓度的DA溶液在电极上孵育4h，通过DA的氨基和DSP的N-羟基琥珀酰亚胺酯之间的相互作用实现目标物的固载。并用去离子水洗涤除去未结合的DA。利用DA的二元醇与APBA硼酸之间的相互作用，将8.0μLAPBA/PANI混合液在电极上温育3h。再用去离子水清洗去除多余的APBA/PANI，ECL传感器被成功制备，如图2.1所示。2.2.7ECL响应测试ECL测试实验在K2S2O8作共反应剂的0.10mol/LPBS溶液中进行。扫描速率为0.2V/s，工作电位设置范围为-1.3~0V。实验中均采用Ag/AgCl（饱和KCl）作参比电极，铂电极为辅助电极，修饰的GCE为工作电极的三电极体系。ECL强度随着固定在电极上的DA量的增加而降低。ECL强度的变化值（ΔI=I0-I）直接反映了DA浓度的变化（I0和I分别表示没有DA和有DA时的ECL强度）。2.3结果与讨论2.3.1材料的表征g-C3N4NS和Au-g-C3N4NS的表面形貌由TEM来进行表征观察。如图2.2A所示，g-C[72]3N4NS的片状结构能够被清楚地观察到，且与文献一致，表明成功地从块状的g-C3N4上剥落出片层的g-C3N4。如图2.2B所示，直径为10~20nm的金纳米粒子均匀覆盖在g-C3N4NS表面。另外，用XPS进一步确认Au-g-C3N4NS的元素组成。如图2.2C所示，能够清楚地观察到C1s（288.38eV），N1s（398.88eV），O1s（533.08eV）和Au4f的特征峰。图2.2C的插图为Au4f双重特征峰，结合能为83.88ef的是Au4f7/2，结合能为87.58eV的是Au4f5/2，该结果表明Au纳米粒子成功地结合到g-C3N4NS上。另外用SEM研究了PANI的表面形貌。如图2.2D所示，纳米棒状的PANI清晰可见，且与文献报道相符，说明PANI被成功合成。17 西南大学硕士学位论文图2.2（A）g-C3N4NS的TEM图像；Au-g-C3N4NS的（B）TEM和（C）XPS谱图;（D）PANI的SEM图Fig.2.2TEMimagesof(A)g-C3N4NSand(B)Au-g-C3N4NS.(C)XPSspectraofAu-g-C3N4NS(inset:high-resolutioncurvesofAuareas),(D)SEMimageofPANIFT-IR用于表征复合材料官能团的特征吸收峰（图2.3）。如图2.3A，对于g-C3N4NS（曲线a），3000~3600cm-1处的宽吸收峰是C-N杂环聚合物边缘的未缩合的-NH2和-NH基团的特征吸收。1407cm-1，1462cm-1和1639cm-1是C-N和C=N拉伸峰。809cm-1处的尖峰是三嗪环振动吸收[73]。与g-C3N4NS的光谱相比，Au-g-C3N4NS的光谱没有明显变化（如图2.3A，曲线b），因为Au纳米颗粒在FT-IR光谱中没有特征吸收带[69]。在图2.3A（曲线c）中，在1082cm-1处能够观察到DSP的C-O的非对称伸缩振动，表明DSP成功组装在Au-g-C3N4NS表面。如图2.3B所示，观察到PANI的特征吸收光谱（曲线a）。在1571cm-1和1559cm-1处的吸收峰对应于醌环的芳香C=C伸缩振动。在1299cm-1，1103cm-1和800cm-1处的吸收峰分别是仲二芳香胺的C-N伸缩振动，=N+-H伸缩振动以及芳香族的C-N面外形变振动。图2.3B中，APBA/PANI的FT-IR光谱类似于PANI的吸收谱图。在3427cm-1和3220cm-1处的峰分别对应于-NH-12和-OH伸缩振动。1373cm处的特征吸收峰对应B-O的吸收[74]，表明APBA/PANI复合材料的成功制备。18 第2章基于双分子识别和聚苯胺的猝灭作用构建检测多巴胺的电致化学发光传感器图2.3（A）g-C3N4和（B）PANI的FT-IR图;（C）g-C3N4和（D）PANI的紫外可见吸收光谱Fig.2.3FT-IRspectraof(A)(a)g-C3N4NS,(b)Au-g-C3N4NS,and(c)DSP/Au-g-C3N4NS;and(B)(a)PANIand(b)APBA/PANI.TheUV-visabsorptionspectraof(C)(a)g-C3N4NS,(b)Au-g-C3N4NS,and(c)DSP/Au-g-C3N4NS;and(D)(a)PANIand(b)APBA/PANI紫外可见光谱用于进一步表征纳米复合材料。如图2.3C所示，在320nm处观察到了g-C3N4的特征吸收峰（曲线a），在曲线b的520nm处出现了Au纳米颗粒的特征峰。此外，随着DSP的引入，Au-g-C3N4NS复合材料（曲线c）相比曲线b并没有特征峰出现。在图2.3D（曲线a）中，在360nm和440nm处可见PANI的吸收峰，对应苯环中的π-π*转移。在曲线b中记录了APBA/PANI复合材料的吸收峰，由于APBA和PANI之间的π-π堆积作用使得360nm处PANI的特征吸收峰发生位移变为354nm。2.3.2修饰电极的CV和ECL行为如图2.4A所示，在循环电势-1.3~0V条件下，检测得到存在或不存在共反应试剂K2S2O8时g-C3N4NS/GCE的ECL响应。由于g-C3N4NS与溶解氧之间的弱的反应而使g-C3N4NS/GCE在没有共反应试剂K2S2O8存在时只有弱的ECL响应信号（如曲线a）。当PBS溶液中有K2S2O8存在时，ECL强度明显增加（曲线b），该检测结果表明K2S2O8能够显著增强g-C3N4NS的ECL信号。以S2-[69]2O8为共反应剂的g-C3N4NS的ECL发射机理如下。首先，半导体g-C3N419 西南大学硕士学位论文得到一个电子产生负电荷的g-C•-2-•-2-3N4（式（1）），同时S2O8被还原成SO4和SO4（式（2））。其次，g-C•-•-3N4与SO4发生反应生成激发态的g-C3N4*（方程（3））;或g-C•-++•-3N4与SO4反应生成g-C3N4（方程（4）），而生成的g-C3N4又会与g-C3N4反应形成激发态的g-C3N4*（方程（5））。最后，激发态的g-C3N4*回落到基态，发出光信号（方程（6））--g-C3N4eg-C3N4（1）2--2--S2O8eSO4SO4（2）-2-g-C3N4SO4g-C3N4SO4（3）Or-2-g-C3N4SO4g-C3N4SO4（4）-g-C3N4g-C3N4g-C3N4g-C3N4（5）g-C3N4g-C3N4hv（6）此外，为了证实AuNPs对g-C3N4NS的ECL响应的促进作用，比较了g-C3N4NS/GCE和Au-g-C3N4NS/GCE的ECL响应。与g-C3N4NS/GCE信号相比，Au-g-C3N4NS/GCE表现出更强的、稳定的ECL响应（图2.4A，曲线c），这归因于g-C3N4NS表面上的AuNPs能够增强电子转移。另外，AuNPs可以储存电子，以抑制过量的高能电子注入g-C[33]3N4NS而造成g-C3N4NS的钝化。因此后续实验中选用Au-g-C3N4NS作为ECL传感器的基底材料。传感器的制备过程用循环伏安法（CV）进行表征，CV实验在5.0mmol/L[Fe(CN)3-/4--16]溶液中实现，扫描速率为0.05Vs。如图2.4B所示，曲线a为裸电极的CV曲线。当DSP/Au-g-C3N4NS孵育到电极上时，由于g-C3N4NS的电导率较差，峰电流降低（如曲线b）[75]。在电极上孵育DA后，氧化还原峰电流略有增加（曲线c），这是因为DA能够促进[Fe(CN)3-/4-6]与电极之间的电子转移。最后，当APBA/PANI被固定在修饰电极上时，由于PANI具有优异的电导性，氧化还原峰电流显著增加（曲线d）[76]。为了进一步验证传感器的成功构建，在含有共反应试剂的0.10mol/LPBS中测试不同修饰电极的ECL响应（图2.4C）。裸电极没有明显的ECL响应（曲线a）。而DSP/Au-g-C3N4NS修饰电极具有强的ECL信号（曲线b），是因为g-C3N4NS本身具有优异的ECL活性，修饰AuNPs后进一步实现了信号的放大。在修饰电极上孵育DA后，ECL信号强度略有增加（曲线c），这可能是因为在DA和Au-g-C3N4NS之间形成了电荷转移络合物，从而加速电子从DA转移到g-C3N4NS的LUMO上促进g-C.-[47,69]3N4的生成。随着APBA/PANI在电极上的固载，ECL强度明显降低（曲线d），这是由于g-C3N4NS与PANI间存在共振能量转移，使得20 第2章基于双分子识别和聚苯胺的猝灭作用构建检测多巴胺的电致化学发光传感器g-C3N4NS的ECL信号降低。能量供体的ECL光谱与能量受体的UV-vis吸收光谱之间是否重叠被用于研究共振能量转移[77,78]。为验证PANI对g-C3N4NS的ECL猝灭作用是能量转移所致，我们检测了PANI的UV-vis吸收光谱和g-C3N4NS的ECL光谱（图2.4D）。在ECL谱图中可见，g-C3N4NS在约460nm处具有最大ECL发射（曲线a），而PANI在300-500nm处有宽UV-vis吸收（曲线b）。从曲线a、b的分布来看，g-C3N4NS的ECL发射光谱与PANI的吸收峰发生重叠，由此说明g-C3N4NS与PANI发生共振能转移的可能性大，即PANI对g-C3N4NS的ECL的猝灭是由于两者间发生能量转移所致。图2.4（A）K2S2O8发光物质的响应影响;（B）CV和（C）ECL响应；（D）光谱重叠图Fig.2.4(A)ECLresponseof(a,b)g-C3N4NS/GCEinPBSsolutionwithout(a)andwith(b)K2S2O8,and(c)Au-g-C3N4NS/GCEinPBSsolutioncontainingK2S2O8.(B)CVand(C)ECLresponseof(a)bareGCE,(b)DSP/Au-g-C3N4NS/GCE,(c)DA/DSP/Au-g-C3N4NS/GCE,(d)APBA/PANI/DA/DSP/Au-g-C3-/4-3N4NS/GCEin0.5mM[Fe(CN)6]and0.10MPBScontaining0.090MK2S2O8,respectively.(D)(a)ECLspectrumoftheg-C3N4and(b)UV-visabsorptionspectrumofPANI2.3.3实验条件的优化PBS的pH值是影响传感器性能的一个重要因素。为了获得足够强的ECL响应，在DA浓度为0.10nmol/L条件下，优化了PBS的pH。如图2.5A所示，pH从5.5变化到7.5时，ECL响应值的变化值（ΔI）随着pH增加不断增加。当pH21 西南大学硕士学位论文值进一步升高时，ΔI明显下降，这是因为低pH条件下质子在负电位容易被还原，因而抑制g-C.-3N4NS的电还原导致信号降低。在高的pH条件下，由于SO4能够与OH-反应而消耗氧化剂SO.-4，最后使得信号降低。在本工作中，选择pH7.5作为最佳pH条件。共反应试剂的浓度是影响ECL响应的另一个重要因素。如图2.5B所示，当K2S2O8浓度从0.060mol/L增加到0.090mol/L时，ΔI值持续增加。但当K2S2O8的浓度从0.090mol/L增加到1.1mol/L时，ΔI逐渐减小。基于g-C2-3N4NS以S2O8为共反应物时的发射机理来看，当产生的g-C*[25]3N4的量增加时，ECL强度增加。尽管如此，过量的K2-2S2O8则会使得S2O8与负电荷的g-C3N4NS之间的相互作用增强，从而抑制激发态g-C*[25]3N4的形成，从而降低了ECL强度。因此，选择0.090mol/L作为K2S2O8的最佳浓度。图2.5（A）pH值和（B）K2S2O8浓度的优化Fig.2.5Theoptimizationof(A)thepHand(B)theconcentrationofK2S2O82.3.4传感器对DA的ECL响应图2.6（A）传感器对不同浓度DA的ECL响应;（B）ECL强度与DA浓度的线性关系Fig.2.6(A)ECLresponseofthesensortowarddifferentconcentrationsofDA:0.1pmol/L,0.5pmol/L,1pmol/L,10pmol/L,100pmol/L,1.0nmol/L,and5.0nmol/L(fromatog);and(B)therelationshipbetweenECLintensityandthelogarithmicvalueoftheDAconcentration22 第2章基于双分子识别和聚苯胺的猝灭作用构建检测多巴胺的电致化学发光传感器在最佳条件下，用所制备的ECL传感器定量检测DA。如图2.6所示，随着DA浓度的增加，ΔI值增加，并且在0.10pmol/L~5.0nmol/L浓度范围内，ΔI与DA浓度的对数值之间具有良好的线性关系。校准方程为ΔI=2399.4×lgc+33709.6（R=0.995），相应的检测限低至0.033pmol/L。此外，本文的检测方法与其他检测DA的方法进行了比较，包括电化学、荧光和电化学发光等（如表2.1）。与其他方法相比，我们制备的传感器具有更宽的检测范围和更低的检测限。这归因于Au-g-C3N4NS强的ECL性能和PANI对g-C3N4NS的ECL强度的有效淬灭作用。Au-g-C3N4NS与PANI的结合提高了对DA的检测灵敏度。表2.1与其他工作对DA检测结果的比较Table2.1.ComparisonwithotherpreviousworksofDAdetectionDeterminemethodLinearrangeDetectionLimitReferencesElectrochemilumiescence0.01~3.0μmol/L0.003μmol/L[79]Fluorescence0.001-10μmol/L0.001μmol/L[80]Electrochemilumiescence0.001-20μmol/L0.0003μmol/L[81]Fluorescence0.05-30μmol/L0.046μmol/L[82]Electrochemical——11±1nmol/L[83]Electrochemical3-110nmol/L0.7±0.019nmol/L[84]Electrochemilumiescence10-200pmol/L3.15pmol/L[85]Electrochemilumiescence0.10-5000pmol/L0.033pmol/LOurwork2.3.5ECL传感器的选择性和稳定性本工作中的ECL传感器利用双分子识别策略实现对DA的检测。因为DSP的氨基反应性的琥珀酰亚胺残基可以与许多物质的伯氨基团反应，所以仅DSP和DA之间的化学识别不足以保证传感器对DA的选择性。因此利用DA的邻位二醇选择性地与硼酸反应形成稳定的环状酯，APBA/PANI中的硼酸与DA邻位二醇之间的相互作用实现对DA的识别，确保了传感器对DA选择性响应。为此，本工作探究了Mg2+、K+、葡萄糖、抗坏血酸对DA检测的影响，以及其他邻苯二酚衍生物如去甲肾上腺素和其他含氨基基团的化合物，如克仑特罗、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等潜在干扰物质对DA检测的影响。结果如图2.7A所示，以上可能的干扰物质由于缺乏特定的识别位点而没能引起明显的ECL信号变化。图2.8显示了克伦特罗、肾上腺素、抗坏血酸、葡萄糖和DA的结构。肾上腺素具有二醇，但不含有伯氨基基团；而葡萄糖和抗坏血酸都具有鸟嘌呤二醇，但不具有氨基基团，因此它们无法被识别。其它含氨基的化合物如克伦特罗和氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）具有伯胺基团，其可与DSP的胺反应性琥珀酰亚胺残基选择性23 西南大学硕士学位论文反应，但缺少邻位二醇，因而不能够将猝灭剂捕获到电极上而实现猝灭。因此，本工作提出的双分子识别策略能够使该传感器对DA的检测表现出较高的选择性。稳定性是决定传感器应用潜能的重要因素。如图2.7B所示，在含有0.090mol/L的K2S2O8的PBS中，从-1.3V~0V的电位下循环扫描10圈，响应结果示于图2.7B。可见，传感器的ECL信号稳定，其峰值的相对标准偏差（RSD）为2.6%，表明该传感器具有可接受的稳定性。这可能是因为一方面Au-g-C3N4NS具有优异的成膜能性；另一方面，传感器是基于化学识别构建的，而形成的共价键是稳定的，因而表现出良好的稳定性。图2.7（A）检测的选择性研究；（B）传感器的ECL稳定性Fig.2.7(A)SelectiveinvestigationofDA(0.1nmol/L)detectioninthepresenceofinterferingsubstances:(a)Mg2+(10nmol/L),(b)K+(10nmol/L),(c)glucose(30mmol/L),(d)ascorbicacid(0.5mmol/L),(e)clenbuterol(10nmol/L),(f)epinephrine(70nmol/L),(g)tryptophan(10nmol/L),(h)tyrosine(10nmol/L),and(i)phenylalanine(10nmol/L);(B)ECLstabilityofthesensorwith0.1nmol/LDA图2.8克伦特罗，肾上腺素，抗坏血酸，葡萄糖和DA的结构Fig.2.8Structuresofclenbuterol,epinephrine,ascorbicacid,glucose,andDA2.3.6回收实验为了评估所制备的传感器的临床适用性，从第九人民医院（重庆，中国）获得人血清样品进行DA浓度分析。利用稀释的血清样品进行加标回收以初步评估传感器在实际样品中的实际应用能力。回收实验通过标准加入方法进行。如表2.224 第2章基于双分子识别和聚苯胺的猝灭作用构建检测多巴胺的电致化学发光传感器所示，使用所制备的ECL传感器检测稀释的血清样品，其DA浓度约3.90pmol/L，在其中加入不同浓度的DA标准溶液，回收率在94.9%至105%范围内，RSD为5.1%，表明所构建的传感器有一定的实际应用性能。表2.2人血清样品中DA的回收率Table2.2RecoveriesofDAintheinhumanserumsamplesAdditionFoundRecoverySample(pmol/L)(pmol/L)(%)0.003.90——Diluted10.014.2102serum50.056.410510098.694.92.4结论本工作基于双分子识别策略以及PANI对g-C2-3N4-S2O8ECL体系的抑制作用实现对DA的灵敏检测。N-羟基琥珀酰亚胺酯/氨基基团与硼酸/邻二醇之间的相互作用实现了对DA的特异性识别，因此与目前使用的方法相比，该方法提高了对DA检测的选择性。另外，Au-g-C3N4NS的强电致化学发光性能和PANI的猝灭效应提高了DA检测的灵敏度。这种构建战略同时为ECL检测小分子提供一种有前景的方法。25 西南大学硕士学位论文第3章基于原位产生和消耗共反应试剂策略构建比率型生物传感器用于次黄嘌呤的检测3.1前言次黄嘌呤（Hx）是腺嘌呤核苷酸的一个重要代谢物，它主要集中在生物组织中[86]。人血清和尿液中Hx的含量能够反映人类的病理状况，如痛风和肾衰竭等[87,88]。此外，Hx还是食品行业中肉类或鱼产品质量监控的指标，随着鱼类产品的日益增加，鱼类的新鲜度备受消费者的关注[89,90]。新鲜度则反映着鱼类、肉类等的各种物理、化学、生物化学和微生物学等的变化程度。因此，实现快速、灵敏地检测Hx具有摘要意义，因为它不仅可以估计鱼类或肉类的新鲜度，还可以实现相关疾病的早期诊断。到目前为止，已经有多种方法实现了对Hx的检测，如毛细管电泳法（CE）[91]、高压液相色谱法（HPLC）[92]以及电化学方法[93,94]。电致化学发光（ECL）作为高灵敏度，低背景信号和快速响应的新分析技术，在食品分析、临床诊断和生物检测方面都受到关注[95-97]，同样也有用于对Hx的检测。例如，Chen等人以鲁米诺作为ECL发光材料构建了ECL生物传感器用于Hx检测[98]。Ju等人使用CdS量子点构建了ECL酶传感器，实现Hx的检测[89]。然而，这些ECL分析方法大都基于单信号的变化，因而容易受到仪器干扰或某些环境因素的影响。基于两个发光物质而构建的ECL比率法可以很好消除外界干扰，提高测定的准确度，因而的已用于生物分析[99,100]。ECL比率法的一个要求是找到两种合适的发光物质，在指定电位下两发光物质有独立的ECL信号。为了解决这一问题，研究者们测试了各种阴极和阳极ECL发光物的组合，例如CdS纳米晶体和鲁米诺[44]，氮化碳和Ru（II）[51]，以及石墨烯量子点和鲁米诺等[101]。然而，许多ECL比率法中，两种发光物质需要共用同一共反应试剂，如H2O2，K2S2O8、三正丙胺等。此外，通常所报道的比率法需要将共反应物添加到测试溶液中以实现信号放大。然而，这些共反应物在水溶液中不稳定或易挥发，因而影响发光物质的发光稳定性和发光效率[32,102]。另外，使用相同的共反应剂也极大地限制了比率法中对两种发光物质的选择。因此，为避免上述比率法中的限制，提出一种新型的ECL比率构建策略是很有意义的。受以上想法的启发，在我们前期工作中构建了一种新的双电位ECL比率法实现了对有机磷农药的检测[103]。实验中，以还原的氧化石墨烯-CdTe量子点（rGO-CdTeQDs）和聚（9,9-二辛基芴）点（PFO）分别作为阴极和阳极发光体，并利用酶促反应中反应物溶解氧和生成物H2O2分别作为两个发光物质的共反应试剂。借助酶促反应中反应物和生成物量的相反变化趋势，方便实现两个发光物质ECL信号的反向变化。该构建策略较好的克服了传统ECL比率法的局限性。但由于PFO的水溶性差限制了其发光效率，从而限制PFO在ECL分析26 第3章基于原位产生和消耗共反应试剂策略构建比率型生物传感器用于次黄嘌呤的检测领域中的应用。因此，开发具有良好水溶性且对H2O2有灵敏响应的新阳极发光体对于构建比率型ECL传感器是非常有必要的。众所周知，鲁米诺及其衍生物具有一定的水溶性和良好的化学稳定性，所以已应用于各个领域。在ECL检测体系中，鲁米诺以H2O2为共反应试剂，在较低的阳极电位（0.6V）条件下以产生强的ECL信号[100]。在我们工作中，以rGO-CdTeQDs作为阴极探针以及鲁米诺为阳极探针构建比率型生物传感器。以溶解氧和H2O2分别被用作两种发光物质的共反应试剂。当Hx存在时，黄嘌呤氧化酶（XOD）可以催化Hx，溶解氧被消耗，并原位产生H2O2，从而引发两个发光物质的ECL信号的呈相反的变化趋势（如图3.1）。最终实现对Hx的比率检测，检测限较低。所用的构建策略很好地避免了假阳性或阴性结果，对其他生物分子也显示出一定的检测潜力。同时，rGO-CdTeQDs与鲁米诺的结合为构建ECL比率生物传感器提供了一种新的选择，特别是对于基于氧化酶的ECL传感系统。图3.1ECL生物传感器的制备过程和对次黄嘌呤的检测原理Fig.3.1SchematicdiagramofthefabricationprocessoftheECLbiosensorandtheprincipleofhypoxanthinedetection3.2实验3.2.1试剂与化学品黄嘌呤氧化酶（来自牛奶，1.0-2.0U/mg），次黄嘌呤（≥99％），鲁米诺（98％）和巯基丙酸（MPA）由西格玛奥德里奇公司（上海，中国）购得；氯化镉水合物（CdCl2·2.5H2O）和碲酸钠（Ⅳ）（Na2TeO3）购自阿法埃莎化工有限公司（天津，中国）；NaBH4和柠檬酸三钠二水合物购自科伦药业（成都，中国）；各种pH值的磷酸盐标准缓冲溶液（PBS）是由KH2PO4（0.10mol/L）和Na2HPO4（0.10mol/L）制备，以0.10mol/LKCl作为支持电解质；人血清样品由第九人民医院（中国重庆）提供。27 西南大学硕士学位论文3.2.2仪器西安瑞迈分析仪器有限公司（西安，中国）提供MPI-A电化学发光分析仪用于ECL测量；CHI610A电化学工作站（上海CH仪器，中国）用于电化学阻抗谱（EIS）的测量；使用透射电子显微镜（TEM，JEM-1200EX）分析各种纳米材料的形态和尺寸；使用UV-vis分光光度计（岛津，日本东京）记录复合物的UV-vis吸收光谱。3.2.3rGO-CdTeQDs的制备rGO-CdTeQDs通过一步法合成[104]。简言之，在圆底烧瓶中先加入50mL去离子水，再将220.0μL1.0mg/mL的氧化石墨烯（GO）和36.89mg的CdCl2·2.5H2O依次加入到烧瓶中并搅拌1h。然后在室温下逐渐加入1.0mLNa2TeO3（0.010mol/L），50.0mg柠檬酸三钠，33.0μLMPA和100.0mgNaBH4并持续搅拌。接着，将混合溶液在130℃条件下回流10h。最后，将生成的rGO-CdTeQDs用乙醇/水（体积比为1:1）洗涤三次。离心后收集沉淀（8000rmp，10min），再分散在去离子水中储存在4℃条件下备用。合成过程中，由于NaBH4的存在，在量子点纳米复合材料中的GO已经被还原为还原的氧化石墨烯（rGO）[103]。3.2.4ECL生物传感器的制备为使玻璃碳电极（GCE，Φ=4mm）的表面洁净，用0.3和0.05μm氧化铝抛光粉依次抛光GCE。然后用水和乙醇净洗，在室温下使其干燥。将10μLrGO-CdTeQDs分散液滴在GCE的表面上，并在室温下晾干。然后将8µL的XOD（2mg/mL）滴加到电极表面并在4℃条件下孵育6h以确保XOD能够结合到电极上。之后，用水洗去未吸附的酶，将3μL0.025％的壳聚糖溶液滴到XOD/rGO-CdTeQDs修饰的电极上得到ECL生物传感器。3.2.5实验检测电极的ECL响应由常规的三电极系统进行检测：Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极，GCE为工作电极。在测量过程中，光电倍增管（PMT）高压设定为800V，电位范围设定为-1.7V至0.6V（相对于Ag/AgCl），扫描速率为200mV/s。测量时将不同浓度的标准Hx溶液加入含有0.04mmol/L鲁米诺的PBS（0.10mol/L）中，并记录仪器的ECL信号。28 第3章基于原位产生和消耗共反应试剂策略构建比率型生物传感器用于次黄嘌呤的检测3.3结果与讨论3.3.1材料表征利用TEM表征rGO-CdTeQDs复合材料的形貌。如图3.2A所示，由于CdTeQDs与rGO之间强的键合作用[105]，大量的CdTeQDs均匀的覆盖在rGO片状结构的表面，表明成功制备了rGO-CdTeQDs。从rGO-CdTeQDs的放大图（图3.2B）和粒径分布图可见，CdTeQDs的平均粒径为4.2±0.8nm。UV-vis光谱用于进一步表征GO和rGO-CdTeQDs。如图3.2C所示，与GO（曲线a）比较，rGO-CdTeQDs复合物在594nm（曲线b）处出现特征吸收，这归因于CdTeQDs的吸收[106]。为了进一步显示rGO-CdTeQDs的特征峰，还提供了rGO-CdTeQDs与GO光谱相减的谱图。如图3.2C的插图所示，能够清楚地观察到594nm处的特征峰，表明成功合成了CdTeQDs。图3.2（A）rGO-CdTeQDs的TEM图像及放大图（B）；（C）UV-vis吸收光谱Fig.3.2(A)TEMimagesofrGO-CdTeQDs;(B)EnlargedTEMimagesofrGO-CdTeQDs(inset:particlessizedistributionofCdTeQDsonthesurfaceofrGO);(C)UV-visabsorptionspectraof(a)GOand(b)rGO-CdTeQDs(Inset:thespectrumofrGO-CdTesubtractedthatofGO)3.3.2生物传感器制备过程的EIS表征ECL生物传感器的制备过程由电化学阻抗图谱（EIS）进行表征，在5.0mmol/L29 西南大学硕士学位论文[Fe(CN)3-/4-6]溶液中进行EIS检测。阻抗光谱的半圆形部分和线性部分分别对应于电子转移限制过程和扩散过程[107]。半圆形部分的半圆直径对应于电子转移的电阻（Ret）。图3.3A分别显示了GCE，rGO-CdTeQDs/GCE，XOD/rGO-CdTeQDs/GCE和壳聚糖/XOD/rGO-CdTeQDs/GCE的电化学阻抗谱。从图中可见，将rGO-CdTeQDs修饰到电极表面后（曲线b），由于rGO-CdTeQDs的导电性较差，使得Ret增加。随后将XOD孵育在修饰电极上时（曲线c），Ret同样增加，因为蛋白质分子层能够阻碍电子的转移。壳聚糖作为一种非导电性聚合物，能够阻碍电极表面电子转移的动力学过程[89]。因此，在电极表面滴加壳聚糖使得Ret增加（曲线d）。以上EIS结果表明ECL生物传感器被成功构建。图3.3（A）EIS表征；（B）XOD孵育时间（C）pH值的优化；（D）CdTeQDs和rGO-CdTeQDs的ECL响应Fig.3.3(A)EISof(a)bareGCE;(b)rGO-CdTeQDs/GCE;(c)XOD/rGO-CdTeQDs/GCE;(d)chitosan/XOD/rGO-CdTeQDs/GCEin0.50mmol/L[Fe(CN)3-/4-6].Theimpedancespectrawererecordedinthefrequencyrangeof10-1-105Hz.(B)TheoptimizationoftheincubationtimeofXOD(20nmol/LofHx).(C)TheeffectofpHvalueontheECLresponseoftherGO-CdTeQDs(blackcurve)andluminol(redcurve);(D)ECLresponseofCdTeQDs/GCE,andrGO-CdTeQDs/GCEin0.10mol/LPBS(pH7.4)3.3.3最优实验条件的选择为了获得灵敏的ECL响应，对XOD的孵育时间进行优化。如图3.3B所示，30 第3章基于原位产生和消耗共反应试剂策略构建比率型生物传感器用于次黄嘌呤的检测当XOD孵育时间从2h增加到6h时，阴极ECL信号强度与阳极ECL信号强度的比值随着XOD孵育时间的增加逐渐降低，6h后达到相对稳定，实验结果表明6h孵育时间足以将XOD吸附到GCE表面从而实现检测。缓冲溶液的pH值是影响生物传感器性能的另一个重要因素。因此探究了pH在6.0~9.0范围内，溶液酸性对ECL响应的影响。如图3.3C所示，rGO-CdTeQDs的ECL强度在不同pH下变化不大，表明rGO-CdTeQDs的ECL信号几乎不受pH影响（黑色曲线）。而鲁米诺的ECL强度则随pH的增加而增加，在pH9.0时达到最大值（红曲线）。但过高的碱性或酸性条件会抑制XOD的活性[98]，从而影响生物传感器的性能。考虑到酶的生物活性，实验最终选择pH7.4的PBS缓冲液用于后续的实验测量。而且，在该pH条件下，鲁米诺也具有强的发光信号用于灵敏检测。3.3.4ECL传感器对Hx的响应为了研究rGO对CdTeQDs的ECL响应的影响，我们比较了CdTeQDs和rGO-CdTeQDs修饰电极的ECL响应。如图3.3D所示，rGO的存在能够有效提高CdTeQDs的ECL强度，这是由于rGO可以有效吸收溶解氧同时促进电子转移[108]。rGO-CdTeQDs以溶解氧为共反应试剂的ECL机制如下[108]：rGO-CdTeQDserGO-CdTeQDs*O22rGO-CdTeQDs2HH2O22rGO-CdTeQDs*rGO-CdTeQDsrGO-CdTeQDsh本工作的比率型ECL生物传感器是以rGO-CdTeQDs作为阴极探针而鲁米诺作为阳极探针构建的，并选择以溶解氧和过氧化氢分别作为阴极和阳极的共反应试剂。尽管O2和H2O2都可以作为两种发光物质的共反应物，但两种共反应试剂对CdTeQDs和鲁米诺的ECL增强效率差别很大。我们测试了在空气饱和的0.10mol/LPBS（图3.4A，曲线b）和N2饱和的0.10mol/LPBS（含有2mmol/LH2O2）（图3.4A，曲线a）中rGO-CdTeQDs的ECL响应。如图所示，空气饱和的PBS中CdTeQDsECL信号明显高于N2饱和且含有H2O2条件下的ECL信号，这表明溶解的O2是CdTeQDs更有效的共反应试剂。这是因为O2比H2O2更容易从电化学还原的CdTeQDs中捕获电子[109]。另外，我们测试了空气饱和的PBS（图3.4B，曲线a）和N2饱和的PBS（图3.4B，曲线b）的鲁米诺的ECL响应，如图所示，ECL以H2O2为共反应物的鲁米诺信号比以溶解氧作为共反应物的信号高约1.5倍，表明H2O2是鲁米诺更有效的共反应试剂，因为H2O2能够产生更多的活性氧从而加速鲁米诺激发态的形成，因而能够更有效地提高鲁米诺的ECL信号强度[110]。31 西南大学硕士学位论文图3.4（A）CdTeQDs的ECL响应;（B）鲁米诺的ECL响应Fig.3.4(A)ECLsignalsofrGO-CdTeQDs/GCEwithH2O2(inN2-saturatedPBS)(curvea)andinair-saturatedPBS(curveb);(B)ECLsignalsofGCEinair-saturatedPBS(curvea)andinN2-saturatedPBS(containingH2O2)(curveb)containing0.040mmol/Lluminol本实验构建的比率法用于定量检测Hx，在酶促反应过程中可以产生和消耗两个发光物质的共反应试剂以引发这两个发光物质的ECL强度呈现相反地变化趋势。XOD催化Hx产生H2O2和尿酸（UA），主要过程如下：XODHxO2XnH2O2XODXnΟ2UAH2O2(黄嘌呤缩写为Xn)根据以上过程可知在Hx存在时能够引发酶促反应，因此溶液中的O2被消耗并原位产生H2O2。随着Hx浓度的变化，溶解的O2和生成的H2O2的量呈现出相反的变化趋势从而使两个发光信号呈现相反变化。如图3.5A所示，当Hx的浓度从0.020nmol/L增加到2.0μmol/L时，rGO-CdTeQDs的ECL强度降低，而鲁米诺的ECL强度增强。Hx浓度的对数值和CdTeQDs与鲁米诺的ECL峰强度比值的对数值呈良好的线性关系。线性响应方程为lgI(CdTe/luminol)=-0.15lgc-1.31,其中I(CdTe/luminol)是rGO-CdTeQDs与鲁米诺ECL信号的比值,c是Hx的浓度。根据公式LOD=kS[111]b/m得到检测限为0.007nmol/L。式中，Sb和m分别是空白样品信号的标准偏差和相应低浓度范围校准曲线的斜率。k是根据所需的置信度选择的数字因子，即信噪比（S/N=3）。与已报道的其他方法相比，我们的传感器显示出更低的检测限（表3.1）。实现HX的高灵敏检测和低LOD归功于ECL技术的优势和rGO-CdTeQDs和鲁米诺的强ECL信号。此外，比率方法减少了检测环境的干扰，提高了检测精度。32 第3章基于原位产生和消耗共反应试剂策略构建比率型生物传感器用于次黄嘌呤的检测图3.5（A）ECL传感器对不同浓度的Hx的响应；（B）校准曲线Fig.3.5(A)TheECLresponseofthesensortowarddifferentHxconcentrations:0.020nmol/L,0.20nmol/L,2.0nmol/L,20nmol/L,0.20µmol/L,2.0µmol/L(fromatof)in0.10mol/LPBS(pH7.4)containing0.040mmol/Lluminol;(B)TherelationshipbetweenlogarithmicvalueoftheHxconcentrationandthepeakintensityratioofCdTeQDstoluminol表3.1与其他已报道的Hx的检测结果的对比Table3.1ComparisonwithotherpreviousworksofHxdetectionMethodLinearrangeDetectionlimitReferenceCE10-1500µmol/L——[44]HPLC15.63-127µmol/L——[51]HPLC-UV1-100µmol/L18.8nmol/L[112]Electrochemical20-512µmol/L9.5µmol/L[93]ECL0.6-200µmol/L0.1µmol/L[98]Electrochemical0.03-28µmol/L10nmol/L[43]Electrochemical2-800µmol/L0.1µmol/L[113]Electrochemical0.398-60.1µmol/L6.17nmol/L[114]ECL0.02-2000nmol/L0.007nmol/LThiswork3.3.5ECL生物传感器的选择性和稳定性选择性是衡量生物传感器能否应用于实际样品检测的重要标准。为了探究传感器的选择性，测试了可能的干扰检测物质，包括多巴胺（DA）、尿酸（UA）、抗坏血酸（AA）、葡萄糖（Glu）、酪氨酸（Ty）和胰蛋白酶（Try）等。当目标物Hx的浓度为20nmol/L时，选择Glu的测试浓度比Hx高4个数量级，以使其与真实样品的测量相对应。对于其他干扰试剂，选择测试Hx与干扰物质浓度比为1:100的干扰浓度。如图3.6A所示，测试的干扰物质对目标物的检测没有引起明显的干扰。这是因为XOD可以特异性识别和催化Hx，但不能对干扰物质如DA、UA、AA、Glu、Ty和Try等产生反应。33 西南大学硕士学位论文图3.6（A）生物传感器的选择性；（B）传感器扫描稳定性和（C）长期稳定性Fig.3.6(A)Theselectiveinvestigationofthebiosensor:(a)blank,(b)AA,(c)DA,(d)UA,(e)Ty,(f)Try,(g)Gluand(h)Hx;(B)ECLstabilityofthesensorwith20nmol/LofHx;(C)Thelong-timestabilityofthebiosensor.Wheren=3foreachpointECL信号的稳定性是评估传感器性能的重要因素。将生物传感器在-1.7~0.6V电位条件下连续扫描测试6圈，结果如图3.6B所示。如图所见，阴极和阳极ECL信号相对稳定，其峰值的RSD分别为3.0％和2.8％。另外我们研究了生物传感器的长期稳定性。将生物传感器储存在4℃条件下，每3天测试一次。结果如图3.6C所示，生物传感器可在9天内保持其良好的ECL响应。当贮存时间较长时，生物传感器对Hx的ECL响应明显降低，这可能是由于XOD是脆弱的短活性酶之一，因此长时间放置可使XOD的活性丧失。3.3.6检测人血清样品中的Hx为了评估ECL生物传感器对Hx检测的潜在适用性，将从第九人民医院（中国重庆）获得的人血清样品用PBS（pH7.4）稀释50倍用于Hx回收实验。通过向稀释了的正常人血清样品中加入不同浓度的Hx来进行回收实验。结果如表3.2所示，传感器对Hx检测的回收率范围为92%~105%，表明该传感器具有在复杂样品中检测目标物的能力，有一定的应用前景。34 第3章基于原位产生和消耗共反应试剂策略构建比率型生物传感器用于次黄嘌呤的检测表3.2Hx在血清样品中的回收实验Table3.2RecoveriesofHxinhumanserumsamplesSampleAddition(mol/L)Found(mol/L)aRecovery(%)10.50×10-90.46×10-99221.00×10-90.93×10-99331.00×10-80.94×10-89445.00×10-84.80×10-89651.00×10-71.06×10-7106a样品的所有测量结果均通过三次平行测试得到3.4结论本工作中，以rGO-CdTeQDs和鲁米诺分别作为阴极和阳极探针构建的ECL比率传感器实现了对Hx的灵敏检测。通过酶的催化原位产生和消耗共反应物，不仅实现了随底物浓度的变化引起两个发光物的ECL信号呈现相反的变化，还避免了使用外加共反应试剂的种种限制。另外，以rGO-CdTeQDs和鲁米诺作为比率方法中阴极-阳极发光体组合为Hx检测提供了新策略。这种新的阴极和阳极发光体的组合也拓展了ECL比率法在生物小分子分析领域的应用。35 西南大学硕士学位论文第4章基于CeO2@Ag纳米粒子修饰的石墨烯量子点作为信号探针的固态电化学发光传感器用于ConA的检测4.1前言电致化学发光（ECL）技术具有灵敏度高、背景信号低、响应范围广和仪器简单等优点，在临床、制药和环境分析领域引起了人们的极大兴趣[115]。发光材料是影响ECL传感器性能的重要因素，特别是在生物分析系统中。传统的发光材料，例如无机发光体Ru(bpy)2+3，有机发光体鲁米诺和半导体量子点（QDs）等，会对生物体表现出高的毒性作用[116]。另外，量子点中的重金属成分也会对环境造成危害[117]，发光物质这些的缺点限制了它们在生物检测方面的发展和应用。因此，为了扩展ECL在生物分析中的应用，仍然有必要开发新型、无毒和高效的ECL发光物质。石墨烯量子点（GQDs）由于其具有良好的生物相容性，高导电性和大的比表面积[118,119]，在各个领域引起了极大的关注。基于低毒性，易于制备和优异的化学惰性[120]等特点，GQDs已应用于生物成像[121]、光学传感[122]和药物传递[123]等方面。同时，以GQDs为发光物质的ECL方法也有报道，例如，用其检测硝基苯胺[124]、蛋白质[125]和DNA[119]等。然而，由于在GQDs的表面和边缘含有富氧官能团使其具有高的水溶性[126,127]，因而很难直接实现其在电极上的固载而构建固态ECL生物传感器。所以，寻找载体以实现GQDs的固定并提高感测灵敏度是必要的。伴刀豆球蛋白A（ConA）作为豆科凝集素家族的一员，于1936年从杰克豆中提取出来[128]。由于其特殊的结构，ConA具有与各种碳水化合物和糖蛋白结合的能力，如甘露糖、辣根过氧化物酶（HRP）和葡萄糖氧化酶(GOx)等[129]。因为ConA与寡甘露糖的亲和力很高，所以它也用于分析细胞表面N-聚糖的表达[130]。同时，由于碳水化合物-凝集素之间的其生物特异性相互作用，ConA因被用作蛋白质模型而受到更多关注，这对临床诊断和药物开发具有重要意义。例如，可使用ConA分析恶性肿瘤细胞等[131,132]。目前已有许多方法用于分析检测ConA，如荧光光谱法[133]、电化学分析法[134,135]和紫外可见吸收光谱法[136]。在这些方法中，ECL技术由于其高灵敏度和低信噪比而在ConA的检测中引起了的更多关注。本工作中，以GQDs作为发光来构建用于检测ConA的固态ECL生物传感器。为了提高生物传感器的分析性能，采用了一些策略来改善生物传感器中生物识别物质的固定和ECL检测中的信号放大。由于CeO2具有良好的催化活性、高导电性、低毒性和大表面积，因此，我们以CeO2@AgNPs为载体来实现对识别物质和GQDs的固定。同时，利用聚酰胺胺（PAMAM）对CeO2@AgNPs表面进行功能36 第4章基于CeO2@Ag纳米粒子修饰的石墨烯量子点作为信号探针的固态电化学发光传感器用于ConA检测化使其带有大量的氨基，从而通过-NH与GQDs的-COOH相互作用实现GQDs的固载（CeO2@Ag-GQDs）以及对ECL信号的有效放大。在制备生物传感器过程中，以电沉积的AuNPs作基底材料以固载识别元件，GOx和GOx-CeO2@Ag-GQD分别作为识别元件和信号探针。在ConA存在的情况下，信号探针将被捕获在电极上并形成夹心型结构（如图4.1所示），得到增强的ECL信号而实现对ConA的检测。该构建策略赋予了生物传感器放大的ECL信号以实现对ConA的检测，同时为构建基于GQDs的固态基ECL生物传感器提供了新的视角。图4.1（A）GOx-CeO2@Ag-GQD的制备过程；（B）ECL生物传感器的构建过程Fig.4.1(A)SchematicillustrateofthepreparationprocessoftheGOx-CeO2@Ag-GQDsand(B)thefabricationprocessoftheECLbiosensor4.2实验部分4.2.1试剂与化学品ConA，葡萄糖氧化酶、牛血清白蛋白（BSA，96%~99%）由西格玛公司（St.Louis，MO，USA）购得；HAuCl4·4H2O、AgNO3、CeCl3·7H2O、柠檬酸钠购自Aladdin公司(上海，中国)；VulcanXC-72炭黑得自CabotCorporation（USA）公司；实验中使用0.10mol/LK2HPO4和0.10mol/LKH2PO4制备具有各种pH值的磷酸盐缓冲盐（PBS）水溶液（0.10mol/L)，支持电解质是0.10mol/LKCl；用0.10mol/LPBS（pH7.0）制备各种浓度的标准ConA溶液；所有试剂均为分析纯。4.2.2仪器ECL检测是通过MPI-A电化学发光分析仪实现的，该分析仪购自西安瑞马克斯电子科技有限公司（中国西安）；循环伏安实验由CHI610A电化学工作站（中国上海CH仪器公司)完成；使用透射电子显微镜（TEM，JEM-1200EX）和扫描电子显微镜（SEM，S-4800，日立，日本）分析各种纳米材料的形态和尺寸；使用紫外可见分光光度计（Shimadzu，日本东京）记录材料的UV-vis吸收光谱；用X37 西南大学硕士学位论文射线光电子能谱（XPS，ThermoelectricityInstruments，USA）分析纳米材料的组成成分。4.2.3GQDs的制备根据文献通过化学氧化XC-72炭黑合成GQDs[127]。简言之，将1.0g炭黑溶于250mL,6mol/L的HNO3中，并在130℃条件下回流24h。然后停止加热，在室温下冷却。将该复合物离心10min（8000rmp）以获得橙色上清液。将所得上清液在200℃下干燥以除去水和硝酸。最后，得到的固体样品即为GQDs。4.2.4制备CeO2和CeO2@AgNPsCeO[136]2纳米球是通过一锅水热法制备得到的。先将20mL柠檬酸钠溶液（10mmol/L）与85mL0.1mol/L尿素溶液混合;然后在不断搅拌作用下加入0.45gCeCl3·7H2O和0.45mLH2O2（30%）。保持搅拌约45min，再将混合物转移至高压釜中，在180℃条件下反应20h。最后，将沉淀离心并在60℃下干燥，以获得CeO2纳米球。根据文献合成AgNPs[137]。首先，将30mL乙二醇加入烧瓶中并在150℃下在搅拌下预热1h。其他试剂溶解在乙二醇中供后续使用。然后在烧瓶中加入0.4mLNa2S（3mmol/L），并在2min后加入10mLPVP溶液（20mg/mL）。之后加入3.5mLAgNO3溶液（282mmol/L）。然后向混合液中滴加0.10mol/L柠檬酸钠溶液。当悬浮液变为棕色时，用冰水浴淬灭反应以获得AgNPs。离心并用丙酮和水洗涤后，将AgNPs再分散在去离子水中备用。CeO2@AgNPs是通过逐层组装的方法制得的。将1mLPDDA溶液（1%）加入到2mLCeO2悬浮液中（1.0mg溶解在2mL水中）。然后超声30min，再将悬浮液离心，除去未吸附的PDDA。之后，将0.5mL制备好的AgNPs在搅拌下加入到CeO2/PDDA混合液中反应3h。最后，经离心和洗涤后获得CeO2@AgNPs。4.2.5制备CeO2@Ag-GQDs和GOx-CeO2@Ag-GQDs向1.0mLCeO2@AgNPs溶液中加入100μLPAMAM，搅拌得到氨基功能化的CeO2@AgNPs。离心除去过量的PAMAM后，加入N-羟基磺基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）（v/v=1:4）并搅拌2h。然后将500μLGQDs加入到上述混合物中在黑暗条件下继续反应2h。然后GQDs将附着在CeO2@AgNPs表面上，因为GQDs的-COOH和PAMAM的-NH2可以在EDC/NHS存在下偶联。离心后收集CeO2@Ag-GQDs并重新分散在1.0mL去离子水中备用。38 第4章基于CeO2@Ag纳米粒子修饰的石墨烯量子点作为信号探针的固态电化学发光传感器用于ConA检测接着，合成GOx-CeO2@Ag-GQDs复合材料。将1.0mLGOx（2mg/mL）加入到CeO2@Ag-GQDs的分散溶液中，并在4℃条件下搅拌4h。将沉淀离心并分散在去离子水中。然后将50μL牛血清白蛋白（BSA，1%）加入到上述GOx-CeO2@Ag-GQDs溶液中反应1h以阻断非特异性吸附。最后，通过离心获得BSA封闭的GOx-CeO2@Ag-GQDs复合物，并将其重新分散在1.0mLPBS（pH7.0）中，储存在4℃条件下备用。4.2.6ECL生物传感器的构建首先，将玻碳电极（GCE，Φ=4mm）依次用0.3和0.05μm氧化铝粉抛光，并用去离子水和乙醇超声处理获得镜面状表面。接下来，经过电沉积将AuNPs沉积在电极表面。接着，将6μL的GOx（2mg/mL）滴在电极上并通过-NH2基团和AuNPs的相互作用固定在AuNPs的表面上。用去离子水洗涤后，滴加1%BSA，并在4℃孵育1h以阻断电极的非特异性结合位点。ECL生物传感器的构建如图4.1所示。4.2.7响应测试将制备的生物传感器在不同浓度的ConA（10μL）标准溶液中孵育1h。因为ConA和GOx的糖残基之间的特异性结合，ConA能够被连接在电极上。然后，将8μLGOx-CeO2@Ag-GQDs滴加在电极上并孵育1h。修饰电极的ECL响应在0.10mol/LPBS（pH7.0）中进行研究，以0.03mol/L的K2S2O8为共反应试剂。在测量过程中，电致化学发光仪的光电倍增管（PMT）的电压设置为800V，电位设置为-1.1V~0V（vs.Ag/AgCl），扫描速率为200mV/s。4.3结果与讨论4.3.1材料的表征TEM和SEM用于表征纳米复合材料的形貌。在图4.2A中，可见CeO2的球形结构，直径约为200~300nm，与文献报道的一致。如图4.2B所示，大量的AgNPs覆盖在CeO2表面（该AgNPs的直径为30~50nm（见图4.3A/B）），表明AgNPs成功附着在CeO2表面。此外，用X射线光电子能谱（XPS）表征CeO2@AgNPs的元素组成。在图4.2C中，882eV，529eV，368eV和285eV处的峰分别是Ce3d，O1s，Ag3d和C1s的XPS谱，这表明存在CeO2和AgNPs。上述结果表明成功合成CeO2@AgNPs复合材料。通过TEM显示GQDs的结构，从图4.2D中能够清楚地看到GQDs均匀分布，其平均粒径为4.1±0.8nm。另外我们测量了GQDs在200~800nm范围内的紫外-39 西南大学硕士学位论文可见光谱吸收，如图4.2E所示，在303nm处可以观察到GQDs的特征吸收峰。位于220nm处的强吸收峰是属于芳香族sp2结构域的π-π*跃迁的吸收[138]。以上结果表明，GQDs被成功制备。图4.2（A）CeO2和（B）CeO2@AgNPs的SEM图；（C）CeO2@AgNPs的XPS；（D）GQDs的TEM；（E）GQDs的UV-vis吸收Fig.4.2SEMof(A)CeO2and(B)CeO2@AgNPs,and(C)XPSofCeO2@AgNPs(insets:thehigh-resolutioncurvesofCeandAg);(D)TEMofGQDs(insets:particlessizedistributionofGQDs).(E)TheUV-visofGQDs利用SEM对电极上沉积的金纳米粒子的形貌进行了表征，如图4.3C所示，在电沉积过程后，金纳米粒子（AuNPs）可在电极表面形成并均匀分布。以此可证明AuNPs成功制备，它们可以用于吸附识别原件GOx，从而实现对ConA的选40 第4章基于CeO2@Ag纳米粒子修饰的石墨烯量子点作为信号探针的固态电化学发光传感器用于ConA检测择性检测。图4.3AgNPs的（A）SEM和（B）TEM图像；（C）沉积金的SEM图像Fig.4.3(A)SEMimageand(B)TEMimageofAgNPs.(C)SEMoftheelectro-depositionAuNPs4.3.2ECL生物传感器的电化学表征记录电极每一修饰步骤的循环伏安图，以监测ECL生物传感器的制造过程。图4.4A显示了裸GCE（曲线a）和纳米复合材料修饰电极的CV曲线。如曲线b所示，在电极上电沉积AuNPs后，由于AuNPs具有优异的导电性，其氧化还原峰的峰电流与裸电极相比明显增加。然后将GOx孵育到AuNPs的表面时，由于酶的抑制电子转移作用，使氧化还原峰电流降低（曲线c）。其次，当BSA（曲线d）和ConA（曲线e）依次修饰在电极上时，由于BSA和ConA的非导电性，使得峰电流连续降低。最后，在GOx-CeO2@Ag-GQDs（曲线f）被捕获在修饰电极上并形成夹心型结构时，峰电流减小，这可能是由于复合物中酶和BSA阻碍电子转移造成的。修饰电极的ECL响应用于进一步表征生物传感器的构建过程。如图4.4B所示，裸GCE（曲线a），AuNPs/GCE（曲线b），GOx/AuNPs/GCE（曲线c），BSA/GOx/AuNPs/GCE（曲线d）和ConA/BSA/GOx/AuNPs/GCE（曲线e）的ECL响应是很弱的，这是因为没有发光物质的缘故。在GOx-CeO2@Ag-GQDs（曲线f）被捕获到修饰电极表面后，由于GQDs具有良好的ECL发光性能以及AgNPs对它的放大41 西南大学硕士学位论文作用，使得ECL强度大大增加。图4.4传感器的（A）CV和（B）ECL响应Fig.4.4TheCV(A)andECL(B)responseof(a)bareGCE,(b)AuNPs/GCE,(c)GOx/AuNPs/GCE,(d)BSA/GOx/AuNPs/GCE,(e)ConA/BSA/GOx/AuNPs/GCE(f)GOx-CeO3-/4-2@Ag-GQDs/ConA/BSA/GOx/AuNPs/GCEin0.5mmol/L[Fe(CN)6]and0.10mol/LPBScontaining0.030mol/LK2S2O8,respectively在以K2S2O8为共反应剂时，GQDs显示出极好的ECL响应，相应的ECL机理描述如下[139]。首先，基态GQDs经电化学还原过程转变为GQDs·-，同时S2-2O8形成SO4·-自由基。然后，在GQDs·-和SO·-4自由基之间发生电子转移湮灭反应，并产生激发态的GQDs*，该激发态GQDs*回到基态时产生ECL信号。过程如下所示：GQDsnenGQDs2-2S2O8eSO4SO42GQDsSO4GQDsSO4GQDsGQDshv为了证明制备的GOx-CeO2@Ag-GQDs探针的优越性。在相同条件下研究了不同探针的生物传感器的ECL响应。如图4.5所示，当修饰电极上捕获GOx-CeO2-GQDs探针后ECL信号增加628a.u.（图4.5A）。这归因于在共反应试剂存在下GQDs的强的ECL响应。当以GOx-Ag-GQDs（图4.5B）和GOx-CeO2@Ag-GQDs（图4.5C）为信号探针并固定在电极上时，ECL强度分别增加2239a.u.和4019a.u.，均高于GOx-CeO2-GQDs的响应强度。原因如下：用AgNPs修饰高比表面积的CeO2，再以PAMAM对CeO2@AgNPs进行功能化后能够为GQDs提供更多的结合位点，实现GQDs的固定。另一方面，AgNPs的高导电性减少了ECL发光物质和电极之间的电子继电屏蔽[140]，进一步增强了GQDs的ECL强度。42 第4章基于CeO2@Ag纳米粒子修饰的石墨烯量子点作为信号探针的固态电化学发光传感器用于ConA检测图4.5不同信号探针的ECL响应Fig.4.5ECLresponsesof(A)GOx-CeO2-GQDs,(B)GOx-Ag-GQDsand(C)GOx-CeO2@Ag-GQDsmodifiedelectrode4.3.3最佳实验条件选择K2S2O8作为GQDs的共反应试剂，对其发光效率影响很大。因此，为了获得足够的ECL强度，实验中测试了不同浓度的共反应物对生物传感器响应的影响。如图4.6A所示，ECL强度随着K2S2O8浓度的增加而增加，并且在0.03mol/L时达到相对稳定的值。因此，最终实验选择K2S2O8浓度为0.03mol/L作为测试ECL响应的最佳浓度。测试溶液的pH值是影响生物传感器性能的另一重要因素。为了研究pH的影响，在5.0~9.0的pH范围内测试了生物传感器的ECL响应。结果记录在图4.6B中，传感器的ECL响应强度随着溶液的pH值从5.0~7.0的增加而增加，然后随着pH值的进一步增加而降低。这可能的原因是质子在较低pH值下容易被还原为氢，从而抑制S2-[141]--2O8的还原，导致ECL强度降低。而在强碱性条件下，SO4会被OH消耗[142,5]，因此ECL强度在较高pH值条件下下降。在pH7.0获得最佳ECL强度，因此选择pH7.0用于后续实验测试。43 西南大学硕士学位论文图4.6（A）K2S2O8浓度和（B）pH优化；(C)传感器的ECL响应曲线和（D）校正曲线Fig.4.6Theeffectof(A)concentrationsofK2S2O8and(B)pHofPBSontheECLresponsesofbiosensor.(C)ECLresponseofthebiosensortowarddifferentconcentrationsofConA:0.5pg/mL,1.0pg/mL,5pg/mL,10pg/mL,50pg/mL,100pg/mL,500pg/mL,1.0ng/mL(fromatoh);and(D)therelationshipbetweenECLintensityandthelogarithmicvalueofConAconcentration4.3.4对ConA的ECL响应测试在最佳检测条件下，研究ECL生物传感器对ConA的检测性能。如图4.6C所示，随着ConA浓度在0.5pg/mL至1.0ng/mL范围内的增加，传感器的ECL信号强度不断增加。ConA浓度的对数值与ECL强度呈良好线性相关，对应的线性回归方程为I=1722.26×lgc+23217.24(R=0.9928)。使用公式LOD=kSb/m[109]计算得到的检测限（LOD）约为0.16pg/mL(其中Sb是空白信号的标准偏差，m是分析灵敏度，k是根据所需的置信度选择的数字因子，即信噪比(S/N=3))。此外，我们与其他文献报道的传感器对ConA的检测结果做了比较，如表4.1。结果显示我们所制备的生物传感器对ConA检测表现出更高的灵敏度，且检测限较低。这可能是因为GQDs具有良好ECL性能，同时以CeO2@AgNPs为载体实现了对其ECL强度有效的增强。44 第4章基于CeO2@Ag纳米粒子修饰的石墨烯量子点作为信号探针的固态电化学发光传感器用于ConA检测表4.1一些分析方法对ConA检测结果的比较Table4.1SomeanalyticalmethodsforthedetectionofConAMethodLinearrangeDetectionlimitReferenceEIS2.23-40μg/mL0.8μg/mL134UV-vis0.08-0.26μmol/L0.04μmol/L135Fluorescence0.4-160nmol/L0.087nmol/L132Fluoroimmunoassay---0.02mg/mL144ECL5-500nmol/L1.24nmol/L133ECL0.001-10ng/mL0.2pg/mL143ECL0.0005-1.0ng/mL0.16pg/mLThiswork4.3.5传感器的稳定性和选择性稳定性是评估传感器性能的重要因素，因此传感器的检测稳定性通过连续扫描测试得到。如图4.7A所示，由于GQDs具有较高的化学稳定性以及ConA与GOx之间的强的相互作用，在对修饰电极连续扫描8个循环后，ECL强度没有明显变化，其信号的相对标准偏差（RSD）为2.7%。为了研究所制备的生物传感器的再现性，在相同条件下测试了由相同方法构建的五个修饰电极。这五个电极间的ECL信号的RSD是4.5%，表明传感器有良好的再现性。为了评估制备的传感器的选择性，测试了可能的干扰物质如BSA、植物血凝素（PHA）和葡萄糖（Glu）。如图4.7B所示，传感器对这些干扰因子的ECL响应很弱，当有ConA的存在时，可观察到强的ECL信号。这是因为ConA与碳水化合物之间的特殊识别作用赋予生物传感器更高的对ConA的选择性。图4.7（A）传感器稳定性；（B）选择性测试Fig.4.7(A)ECLstabilityofthesensorwith10pg/mLConA;(B)TheECLresponsesofthebiosensorto10pg/mLConA,100pg/mLinterferencesand10pg/mLConAwith100pg/mLinterferences45 西南大学硕士学位论文4.3.6传感器对实际样品的检测为了评估所制备的生物传感器的实际应用潜能，使用标准加入方法来检测人血清样品中的ConA。人血清样品来自中国重庆市第九人民医院，然后用PBS（pH7.0）稀释50倍进行检测。结果记录在表4.2中，所制备的ECL传感器显示出良好的检测结果，回收率范围从95%至102%（RSD值为4.2%），表明传感器在复杂环境中对ConA任有良好的检测性能。表4.2血清样品进行的回收实验Table4.2DeterminationofConAaddedinhumanserumsamplewiththedevelopedbiosensorSampleAddition(ng/mL)Found(ng/mL)Recovery(%)10.01000.010210220.05000.05210430.1000.0959540.5000.48897.64.4结论本工作以GOx-CeO2@Ag-GQDs为ECL探针构建用于灵敏检测ConA的ECL生物传感器。在此，CeO2@AgNPs不仅实现了对GQDs的固载，而且有效提高了GQDs的ECL强度，从而提高了检测灵敏度。实验结果显示，由于ConA和糖蛋白之间的特殊结合能力，所制备的生物传感器实现了选择性检测ConA。此外，鉴于GQDs的低毒性，优异的化学惰性等优势，所采用的构建策略扩展了GQDs在ECL传感中的应用，也为应用基于GQDs的固态基ECL生物传感器的构建提供了新思路。46 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西南大学硕士学位论文作者相关论文题录FumeiZuo,LinJin,XiaominFu,HanZhang,RuoYuan,ShihongChen,Anelectrochemiluminescentsensorfordopaminedetectionbasedondual-moleculerecognitionstrategyandpolyanilinequenching.SensorsActuatB.,2017,244,282-289.(IF=5.401)FumeiZuo,HanZhang,JiXie,ShihongChenandRuoYuan.Asensitiveratiometricelectrochemiluminescencebiosensorforhypoxanthinedetectionbyinsitugenerationandconsumptionofcoreactants.Electrochim.Acta,2018,271,173-179.(IF=4.798)FumeiZuo,HanZhang,ShihongChen,RuoYuan.Asolid-stateelectrochemiluminescencebiosensorforConAdetectionbasedonCeO2@Agnanoparticlesmodifiedgraphenequantumdotsassignalprobe.Electrochim.Acta(投递中)60 致谢致谢研究生的生活是繁忙的，短暂的。大概是因为这样，这重庆便以她独特方式表达着热情以给予安慰。于是见那花儿常开，那树也常青，那雨也是细细绵绵的，那风也是轻轻柔柔的。太阳倒是火辣的厉害，即使是秋天也依旧。于是伴着欣喜，在这三年里看了这山水的秀丽，也见到了这山水养育出的佳人，感受过山城人民的热情与智慧，于是我觉出了这城市的柔情，于是便怀念了。我知道时间是快的，只是长大后似乎又快了许多。我以为三年很长，却也不过几百天罢了，不过若换来成长那就是极好的。我感谢我遇到的每个人，你们教会了我太多的东西，你们给予了太多的关爱和照顾，你们给了我太多的鼓励与包容。你们虽不是圣人，却救赎了我。于是我成长了，但你们不曾在意吧，我不曾回报过，叫我如何回报？几句谢谢说的太轻，说我们来日方长？可有多少个来日可再见？既然遇见便是缘，所以我珍惜。虽然一句谢谢不能够承载你们对我的付出，但我还是要说谢谢遇见你！那么在这里我首先感谢我的导师陈时洪老师给予机会让我来到西南大学，让我有机会进入到实验室体验这充实的生活。感谢老师在科研、学习、生活等多方面给予的指导和帮助让我受益匪浅，感谢三年来老师对我的理解和包容，让我在这一学科领域增长了见识、在生活中锻炼了自己。另外，特别感谢袁若教授和柴雅琴教授为我们提供良好的实验环境、丰富的实验资源、良好的学术氛围，让我们能够方便获取知识，成就自己。实验中袁若教授和柴雅琴教授给予的教导让我在今后的学习工作中受益颇多。此外，还要感谢课题组的卓颖老师、向云老师、王海军老师、梁文斌老师、杨霞老师、许文菊老师、钟霞老师、袁亚丽老师等对我实验中给予的帮助和指导，让我能够克服实验中的困难。还要感谢冯晓辉这位亲切的姐姐，在实验及生活里提供了很多的帮助。再者，衷心感谢张璞、周莹、常园园、付晓敏、谌红梅、范雨师姐们对我的帮助。从最基础的实验开始一直到最后的实验完成、文章的写作等，都有师姐们的细心和耐心的帮助，助我成长。感谢实验室的同级伙伴张涵、胡远如、吴芳芳、彭丽春同我一起面对实验中的坎坷，帮我解决诸多的困难。感谢师妹张聪、罗金华、胡晓霞、聂亚敏、刘堤、王娟丽等，是你们的乐观和勇敢教会我乐观的面对生活。还要诚挚感谢我的室友赵静、彭英、张小芳、寇贝贝、雷婉婉，你们不介意这样的我，总是时时刻刻帮我、关心我。在你们的陪伴中我度过的我的研究生生涯，在这其中我收获了太多，我感谢所有人对我的包容和照顾。我自知一句谢谢太过简单，但也请你们收下我这微不足道的感谢。61 西南大学硕士学位论文我在这里还要感谢我最亲爱的家人，你们给予我太多太多。我知父母辛苦却不言，我知父母在我远出挂念而不提，谁言寸草心，报得三春晖？感谢你们在我迷茫时的循循善诱，在我彷徨时伴我左右，在我沮丧时给予安慰与鼓励。我很幸运我曾遇见你们，所以我走过，所以我留恋！我有幸来到西南大学，更幸运的是遇见了你们。我愿将来的我们都变成我们喜欢的样子，愿将来的生活过成我们向往的样子！愿将来的我们性情依旧，愿将来的你们依旧！左富梅2018年3月20日62
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