肝素酶在幽门螺杆菌感染致胃癌发病机制中的作用及其临床意义

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1、分类号：R6密级：公开研究生学位论文肝素酶在幽门螺杆菌感染致胃癌发病机制中论文题目（中文）的作用及其临床意义Theeffectsandclinicalsignificanceon论文题目（外文）heparanaseofgastriccancercausedbyHelicobacterpylori研究生姓名刘丽平学科、专业外科学•普通外科研究方向消化系肿瘤学位级别博士导师姓名、职称李玉民教授论文工作起止年月2014年9月至2018年9月论文提交日期2018年10月论文答辩日期2018年12月学位授予日期校址：甘肃省兰

2、州市I肝素酶在幽门螺杆菌感染致胃癌发病机制中的作用及临床意义中文摘要目的：胃癌是全球范围内发病率和死亡率都高的恶性肿瘤，在我国发病率更高。幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，H.pylori）被列为人类胃癌的I类致癌物。肝素酶(heparanase，HPA)是一种β-D葡萄糖醛酸酶，可降解细胞外基质和基底膜中的硫酸乙酰肝素，参与了组织重构和细胞迁移，包括炎症、血管形成和肿瘤转移。本研究的目的是通过使用H.pylori感染胃癌细胞MKN-45和胃癌患者组织的检测及分析，进一步明确胃癌中H.pylori感

3、染和HPA的关系及其机制。方法：将H.pylori与胃癌细胞MKN-45共培养，采用RT-PCR法和Westernblot法在不同的时间点分别检测HPAmRNA和HPA蛋白表达变化；Westernblot法检测MAPK、NF-kB信号分子在H.pylori与MKN-45共培养不同时间点的磷酸化激活水平变化；MKN-45与H.pylori共培养前，使用MAPK抑制剂SB203580干预，检测NF-kB水平的变化；给予SB203580干预后，采用RT-PCR法和Westernblot法检测HPAmRNA和HPA蛋白表达

4、变化，同时采用CCK-8法检测细胞增殖情况，Transwell法和划痕试验检测肿瘤细胞侵袭迁移能力；采用SiRNA干扰技术沉默HPA后，采用RT-PCR法和Westernblot法检测HPAmRNA和HPA蛋白表达变化，同时采用CCK-8增殖试验和克隆试验证实肿瘤细胞的增殖和克隆形成能力。收集胃癌术后病例组织，通过术前胃癌患者C-13呼气试验和胃癌和癌旁组织免疫组化法检测胃癌组织中H.pylori感染情况；通过免疫组织化学法检测HPA、MAPK在胃癌组织和癌旁组织中表达，分析H.pylori感染与胃癌组织中HPA、

5、MAPK表达的相关性，同时分析H.pylori感染、HPA、MAPK蛋白表达和临床病理特征的相关性，Kaplan-Meier生存曲线被采用去分析胃癌组织中HPA表达阳性病例与胃癌患者的III总生存率（overallsurvival，OS）和无复发生存率（relapse-freesurvival，RFS）的相关性，同时分析H.pylori阳性的胃癌患者中HPA蛋白阳性表达与OS和RFS的相关性，采用COX风险回归模型（单因素和多因素）分析影响胃癌患者预后的因素，进一步阐明胃癌中HPA蛋白表达的临床意义和预后判断价值，

6、进而为H.pylori感染诱发胃癌的机制提供理论依据。结果：胃癌细胞与H.pylori的浓度比为1：100共培养后，我们发现H.pylori感染能明显诱导胃癌MKN-45细胞中HPAmRNA和HPA蛋白表达均明显增高，而且呈时间依赖性增高，HPAmRNA在共培养6小时达峰值，随后随时间逐渐下降，HPA蛋白亦随时间逐渐增高，在24小时达峰值，随后逐渐下降；信号通路MAPK和NF-kB磷酸化激活检测表明，H.pylori感染MKN-45能显著诱导p-p38MAPK和p-p65NF-kB水平增高，p-p38MAPK在共培

7、养30分钟时增高，60分钟时达峰值，而p-p65NF-kB在共培养后240分钟时达峰值，随后两者均随时间逐渐下降；给予MAPK抑制剂SB203580在共培养前2小时预处理MKN-45细胞，共培养后检测p-p65NF-kB明显下降；给予SB203580干预后，HPAmRNA和HPA蛋白表达均明显下降，同时肿瘤细胞增殖、侵袭迁移能力均明显下降；采用SiRNA干扰技术沉默HPA后，HPAmRNA和HPA蛋白表达均明显下降，同时检测肿瘤细胞的增殖和克隆形成能力均下降。99例胃癌患者中70例感染H.pylori，感染率70.

8、7%，此感染率明显高于健康体检者，其感染率40%，而且H.pylori感染与胃癌组织淋巴转移密切相关。H.pylori感染与HPA表达和MAPK表达均密切相关(P=0.012andP=0.040)，此外HPA表达和MAPK蛋白表达仍密切相关(P=0.024)。组织学检测提示胃癌组织中的HPA蛋白表达阳性率（69.7%）明显高于癌旁组织（42.4%）和健康体检