高通量测序技术在宏基因组学中的应用

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1、196中国医药生物技术2013年6月第8卷第3期ChinMedBiotechnol,June2013,Vol.8,No.3DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.03.008·综述·高通量测序技术在宏基因组学中的应用刘莉扬，崔鸿飞，田埂随着生命科学及研究技术的不断发展，人们对生命现象量较低，比较适合对16SrRNA进行测序及分析。随着高的了解更加深入。微生物因为其在工业、农业、医疗卫生、通量的第二代测序（nextgenerationsequencing，NGS）方法环境保护等各方面的重要地位，被越来越多的研究者关注。的诞生，由于读

2、长较短，所以从一次测序16SrRNA基因自然状态下，微生物几乎无处不在，无论是在自然环境如土全长，到只针对16SrRNA中的某一个或某几个高变区进[8-11]壤、海洋甚至一些极端环境（如酸矿水）中，还是在人类和行分析和研究。动物的皮肤、口腔、肠道中，微生物都与它们所在的环境相宏基因组包含着环境微生物的全部遗传信息，相比于伴相生。除生存环境极为广泛以外，微生物的数量还极为庞16SrRNA来说，宏基因组除了群落中各种微生物的分类信大，以人类为例，人类的基因总数只占人类身上微生物基因息以外，更包含了所有微生物的基因信息。因此，这种数据[1]总数的1%左右。这些微生物是环境能

3、量、物质代谢的更有助于我们对群落潜在的功能进行深入分析。并且通过对重要中间环节和组成部分，它们有些可以代谢生成周围其他基因组大小进行均一化（normalization），我们可以对群落中[12]生物所必需的底物，而有些则会代谢生成毒性物质，导致环的微生物进行相对定量研究。功能基因研究则可以通过[13]境污染，或者宿主的疾病。因此，对微生物的研究显得极为测序序列找到特定环境下富集的功能基因。宏基因组是重要。近年研究的热点，数据量较为庞大，尤其需要高通量的测序微生物的传统研究方法主要是依赖将微生物进行培养技术和高效的数据处理能力作为依托。和分离（culture-depen

4、dent）。然而，到目前为止，绝大多数宏转录组数据则包含了环境微生物的全部转录本信息。微生物（99%以上）不能依靠这样的方式获得，这极大地与宏基因组中研究“可能的”群落功能、代谢通路差异相比，限制了人们对微生物的研究。随着测序技术和数据处理分析宏转录组可以实时、实地的对微生物群落的基因表达情况进[14]能力的飞速发展，以及人们对微生物之间相互依存的共生互行反映。在新一代测序技术出现以前，利用传统测序技利和平衡关系的深入认识，一种可以对环境中所有微生物进术发展出了使用EST序列来发现新基因的方法，比较方便[15]行研究而不依赖培养的新方向——宏基因组学应运而生。地得到了

5、大量的基因序列的信息。新一代测序技术的出现，给宏转录组的研究带来了新的机遇，但是由于原核生物1宏基因组简介的mRNA较易分解、rRNA含量极高，高质量的样本制备[16]宏基因组（Metagenome），或称为“元基因组”，于1998比较困难，因此现在的研究仍属于起步阶段。[2]年由Handelsman等在一篇研究土壤微生物的文章中首次提出，当时的定义是“微生物群落中的所有基因组的集2测序技术的发展与高通量测序技术的特点合”。在此之后，宏基因组的概念渐渐为人们所接受，并涌世界第一台自动化测序仪诞生于1987年，由美国[17]现了许多针对海洋、土壤、人类肠道等微生物的典型

6、研究工ABI公司制造，其原理基于Sanger测序法。Sanger测[3-6]作，目前的宏基因组研究主要指对细菌的研究。序因其较长的读长（~1000bp）和较高的测序质量宏基因组学研究与传统微生物研究方式的最大区别在（99.999%），从20世纪90年代开始，就被广泛应用在生于把微生物看成一个整体，摆脱了对单个微生物培养和分离物信息学研究当中，并在人类基因组计划（humangenome[18]的步骤，直接对环境中所有的微生物进行研究，进而可以全program，HGP）中发挥了巨大的作用。但Sanger测序面地对所有微生物进行分析。随着宏基因组学研究技术的发法由于测序通量

7、太低，速度较慢，渐渐不能满足日益增多[19]展和研究者兴趣的不断增加，对其研究手段和研究对象的重的数据需求。第二代高通量测序则避免了Sanger测序点也不断发生着变化，大致可以分为三个阶段：①针对16S中所需的繁琐的克隆过程，大大减少了工作量，提高了效rRNA为主要研究对象的核糖体RNA研究；②以环境中所率。随着测序技术的不断发展，单分子测序的技术，如[20][21]有遗传物质为研究对象；③以环境中所有转录本为主要研究HeliScope、Picbio等测序技术逐渐开始发展。但由于技对象的宏转录组研究。狭义的宏基因组学研究指第二个阶段，本文提到的“宏基