转基因小麦外源基因插入位点初步分析及检测方法的建立

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1、生物工程粮油食品科技第卷年第期转基因小麦外源基因插入位点初步分析及检测方法的建立口段晓亮，许兰杰刘志勇、梁荣奇中国农业大学农学与生物技术学院，北京国家粮食局科学研究院，北京摘要：利用染色体步移（原理和巢式方法，对转基因小麦外源基因插入位点的序列特征进行了分析，并以此建立了基因转化事件特异性检测的方法。根据基因的核苷酸序列设计特异引物，利用公司提供的简并随机引物，通过染色体步移法扩增到了转基因祙系的插入位点的边界序列，分析得到的边界序列可知，外源基因片段是通过部分同源重组的方式与小麦基因组进行整合的整合位点位于染色体组。检

2、测结果显示携带外源基因的质粒在与小麦基因组整合的过程中发生了剪切且启动子与基因被切除保留了两个串联的基因，且在区间发生了重组后的缺失，而在区间有一段碱基序列插入导致插入区段的小麦基因组序列发生重排，初步分析外源基因是通过同源重组的方式进行整合的。通过验证，证明了插入位点信息的准确性并初步判断插入位点位于小麦染色体组。因此，随机引物法可以作为转基因小麦安全检测及身份识别的有效方法。关键词：；转基因小麦插入位点；边界序列；检测方法中图分类号文献标识码文章编号，；：一，，：；；；；转基因作物的优越性使得其成为解决粮食安全转基因

3、作物带来巨大效益的同时，关于转基因食品的重要手段，随着转基由作物的大面积推广应用，转的安全性及对生态环境的影响等问题也成了关注的基因产品必将大量地进人消费市场。然而，在焦点另外，转基因作物品种的专利保护问题、转基――因产品的标识问题也引起了政府与民众的高度收稿日期；基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（关往。我国于年月日颁布了《农业转基因作者街介：段晓亮男，年出生在读博士丄二二二通讯作者：梁荣奇男年出生副教授博士生物安全管理条例》，年月日开始头仃粮油食品科技第卷年第期生物工程的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对

4、农的表型很难预测。另外由转化基因插入位点的不确业转基因生物实行检验检疫和标识制度一。欧盟已通定性引起的基因表达水平的不致往往导致转基因过转基因作物试种知情权法案。通常情况下，转基株系间表达差异的悬殊。因此，阐明外源基因在植因食品的检测主要包括核酸和蛋白质的检测，核酸物基因组中的整合机制对设计高效的转化策略具有的检测主要是检测遗传物质中是否含有插人的外源重要的意义。基因，而蛋白质的检测主要是通过检测插入外源基对于转基因作物中外源基因的检测，国内外已因表达的蛋白质产物或其功能经形成了一，其检测技术方法主系列常用的方法，如竞争

5、要包括基于免疫学基础的、法和、实时定量』试纸条法等。王晓波等对转基因的大、方法、环介导等温扩豆进行插入位点检测结果显示外源基因的插入导增检测技术等。但这些方法均不能明确插入外致一个编码和两个功能域的基源序列在植物基因组中的位置，而这些信息在因（结构受到影响。国内还没有欧洲和美洲转基因食品安全评价中是必需提供的资关于转基因小麦插人位点边界序列分析的相关料。我国对于转基因作物的环境释放环节要报道。求提供外源基因插入位点的信息但是这方面的研外源基因的转化途径主要可以概括为个转化究报道较少。因此，开展转基因品种的外源基因插体系农

6、杆菌介导的植物转化体系、直接导入的转化人位点以及外源基因与受体基因组的整合研究，对体系（基因枪）以及种质系统介导的转化体于我国转基因安全评价具有重要意义。一系一种重。但无论哪种转化方法外源基因的整合机制染色体步移技术（是都是一个未知领域。等人分析了转基因水稻要的分子生物学研究技术使用这种技术可以有效的外源基因以及整合插人位点的序列结构特征提获取与已知序列相邻的未知序列，主要用于克隆启“两步整合机制模型”动子出了转基因是通过（、鉴定或转座子的插人位点等研⋯。进行整合的，即究原理：根据已知序整合前与整合两个阶段，提出了重组热

7、点以及转基列，分别设计三条同向且退火温度较高因串联子等概念用来解释整合前阶段。而整合阶段的特异性引物，与试剂盒中提供的种中外源在整合热点开始整合进受体基因组并经过独特设计的退火温度较低的兼并引物，即、引导其它转基因分子在邻近区域相继整合，因而也、、进行热不对称反应。通常情况一，其中至种兼并引物可以与特异性引物之就导致了多拷贝出现的问题，不同转基因位点之间下少有被的植物隔开形成转基因簇间利用退火温度的差异进行热不对称反应，通。对转基因在植物基因组中的整合过次巢式反应即可获取已知序列的侧翼序一位点结构分析表明。如果次实验获取

8、的长度不能满足实验要求，异常重组可能是转基因整合的列还可以根据第一主要机制异常重组包括微同源序列和非同源序列时，次步移获取的序列信息，继续进间的重组尽管转化方法不同，外源基因间的重组连行侧翼序列获取具体方法原理如图所示。接点通常具有微同源重组的某些特征一本研究以前期得到的转基因小麦纯合株：如两个或个重组末端有核苷酸缺