马铃薯Y病毒CP基因介导抗性与转基因整合方式的关系及抗性传导

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1、山东农业大学博士学位论文马铃薯Y病毒CP基因介导抗性与转基因整合方式的关系及抗性传导姓名：刘红梅申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：温孚江2003.5.25关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容

2、编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：剑垫斟导师签名：三猪f万日期：坐占·z／山东农业大学博士学位论文摘要?／RNA介导抗病性作为一种获得抗病毒作物的有效策略，因具有抗性表型近乎免疫、抗性持久以及生物安全性高等特点，越来越受到重视，成为植物抗病毒基因工程的研究热点。利用该策略已获得了抗病毒植株，涉及多种病毒和植物。但目前对RNA介导病毒抗性机制还不清楚，RNA介导抗性离实际应用也还有一定距离。王一，Q7本研究的主要内容包括：利用已获得的转非翻译PVYCP(pPVYCPM

3、)不同抗性的烟草．研究外源基因的整合方式与RNA介导病毒抗性的关系：通过不同抗性材料的嫁接试验，对RNA介导抗性的传导规律以及马铃薯Y病毒(PVY)的传播移动规律加以研究。具体结果如下：1．在转pPVYCPM基因烟草Southernblot分析时发现。同一转基因植株的基因组DNA用不同酶切时所得到的拷贝数不同，如用HindlII酶切时M4—1，M74—1，M84一l，M18—1的拷贝数分别为7，6，5，4；而用EcoRI酶切拷贝数分别为2，4，4，5。侈数情况下，胁H讲Ⅱ酶切所得拷贝数多于用EcoRI酶切。特别是当转基因以多拷贝整合时，由于转基因串联重复序

4、列的存在，酶切产生大小相同的带，Southernblot往往不能准确反映转基因的真实拷贝数，因此应选择能产生最多杂交带的酶。重复序列的存在使杂交带间信号强弱不一，为了使结果更精确，确定拷贝数和杂交带的大小时应以放射自显影的x光片为准。】，p／2．对转pPVYCPM基因的不同抗性转基因株系T．代的研究表明，转基因的拷贝数与植株的抗病性有一定的联系。偷度抗病和抗病植株往往含有多拷贝的转基因，崩r硼II和EcoRI酶切的平均拷贝数为5和3；感病植株拷贝数较少，HindlII和EcoRI酶切的平均拷贝数分别为2．3和3．1。这说明拷贝数与抗病性有关，但也有例外如M

5、4—3，M7—1虽然拷贝数较高，但不含串联重复序列．表现为感病。这说明拷贝数并不是决定抗病性的关键因素。凡／／。3．从已获得的转非翻译PVYCP基因烟草中选取高度抗病和感病株系各4份，对其Tl代植株分别进行卡那霉素抗性鉴定、PCR检测和PVY“抗病性鉴定。／分别用HindllI和EcoRI对不同抗性的Tl代植株基因组DNA进行单酶切，以0．8kb的PVYcP基因片段作为探针Southernblot分析表明，高度抗病的转基因植株中大多含有转基因的串联重复序列，而感病转基因植株则不含。串联重复分正向重复(directrepeat)和反向重复(invertedr

6、epeat)两种类型，抗病转基因植株含有其中之一或二者兼有。说明串联重复序列是决定RNA介导抗性的关键，发生于不同物种上不同诱因的转录后基因沉默(PTGS)最终都以双链RNA(dsRNA)为汇合点，这也是各种形式的PTGS最大的共同点。而多拷贝转基因重复序列能够通过对相邻转基因的通读转录产生这样的dsRNA，而dsRNA被认为是触发PTGS的关键。可见转基因拷贝数对于RNA介导抗性并不是一种剂量效应而是一种质量效应。)／广马铃薯Y病毒RNA介导抗性与转基因整合方式的关系及抗性传导规律4．高度抗病株系M13To、T．代卡那霉素抗性鉴定、抗病性鉴定和South

7、enblot分析表明，T．代与T。代相比，卡那霉索抗性和抗病性分离较小，分别为2．1％和6．2％。T。代杂交带型和拷贝数有较大分离，但多数仍为多拷贝，表现高度抗病。胀据高度抗病株系T。代抗病性、卡那霉素抗性分离率较低，遗传背景一致的特点，可以考虑将分子生物学手段与常规育种相结合，对T。代株系进行全面鉴定，筛选多拷贝高度抗病植株进行组培扩繁，将其T．代直接作为品种用于生产。土夕75．单嫁接实验表明，PVYCP介导的抗病性并不能从高度抗病砧木传到上部转基因感病接穗或未转基因的接穗。fRNA介导的抗病性是系统性的，一旦产生整株都不发病，这一现象说明植株体内可能存

8、在传导的抗性信号。而病毒在植株体内是通过韧皮部进行长距离传播的，因