HCV亚基因复制子QSG7701细胞株的建立及CTE核酶对HCVRNA复制的影响

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1、硕士学位论文中文摘要摘要目的建立RNA转染的HCVSubgenomicReplicon(HCV亚基因复制子)稳定转染和表达的细胞株；探讨CTE-核酶对丙型肝炎病毒亚基因组RNA复制的影响。研究方法1．在T7体外转录RNA试剂盒介导下，将含有HCVSubgenomicReplicon的质粒pHCVBM4—5转化为RNA。2．建立HCVSubgenomicReplicon稳定转染和表达的细胞株在脂质体lipofectamineTM2000介导下，将含有HCVSubgenomicReplicon的RNA

2、导入人肝癌细胞系QSG7701中，经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法证实HCVSubgenomicRepliconRNA复制及其蛋白表达。3．观察普通核酶pPHCV5．R1、pPHCV5．R2和CTE一核酶pPHCV5一CRl、pPHCV5一CR2瞬时转染含HCV亚基因复制子QSG7701。48小时后收集细胞，提取细胞总RNA，采用RT-PCR方法，观察核酶对HCV5’．NCR切割效果。幺}电当日木1．经RT-PCR和Wester

3、nBlot证实，成功建立HCVSubgenomicRepliconRNA稳定转染QSG7701细胞株。2．经RT-PCR证实：pPHCV5．CRl转染组未见明显HCV5’-NCR硕十学位论文中文摘要扩增目的条带，pPHCV5．R1转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组；pPHCV5．CR2转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组，pPHCV5．R2转染组可见扩增目的条带，亮度与未转染组接近。这些结果提示：CTE．核酶在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，CTE．核

4、酶能进行有效的切割：普通核酶能进行切割的位点，带CTE．核酶的切割效率明显提高。结论1．成功建立HCVSubgenomicRepliconQSG7701细胞株。2．CTE．核酶在细胞内切割HCVRNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，CTE．核酶也能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE．核酶的切割效率明显提高。关键词亚基因复制子丙型肝炎核酶硕士学位论文英文摘要ABSTRACTobjeetiveToestablishaHCVSubgenomicRepliconcellli

5、ne；Tostudytheeffectofribozyme-CTEonintracellularHCVmRNA。Methods1．TheplasmidpHCVBM4-5withHCVSubgenomicRepliconwastranslatedintoHCVSubgenomicRepliconRNAUsingRiboMAXExpressT7。2．TheHCVSubgenomicRepliconRNAweretransfectedintoQSG7701cellsUsingLipofectmine刑2

6、000，andthenselectedthecellclonewithG418。Thenon—transfectedQSG7701cellsascontrol。ThestablecelllinewasverifiedbyRT-PCRandWesternBloaing。3．ToobservetheeffectofpPHCV5-R1，pPHCV5-R2，pPHCV5一CRlaswellaspPHCV5一CR2onHCVSubgenomicRepliconRNAreplication。Result1．H

7、CVSubgenomicRepliconQSG7701stablecelllinewasstablished，whichwasverifiedbyRT-PCRandWesternBlotting。2．TheplasmidsthatcontaintheseclassicribozymegenesandnewribozymegenesweretransfectedintoQSG7701cellsusingLipofectmine刑2000。Thefollowingexperimemswerecarri

8、edoutafter48hoursoftransfection．RT-PCRandWesternBlottingwereusedtodetectHCVRNAandcorrespondingproteinrespectively。TheresultsofIll硕士学位论文英文摘要RT-PCRsuggestedthatthosenewrebozymeswithCTEcouldcuttargetRNAsmoreeffectivethanclassicribozymeswithoutCTE