高糖对人脐静脉内皮细胞GSH.PX活力、NOS及ICAM.1表达的影响

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1、高糖对人脐静脉内皮细胞GSH.PX活力、NOS及ICAM.1表达的影响作者：曾玉，邓红，王筠，苏宁，刘东风［摘要］目的:探讨体外培养条件下高糖状态对血管内皮细胞的影响。方法:培养人脐静脉内皮细胞株ECV304，分为对照组和高糖组，用分光光度比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH.PX）活力，RT.PCR法检测细胞间粘附分子1（ICAM.1）mRNA水平，免疫细胞化学法观察内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白表达。结果:高糖组GSH.PX活力明显下降，eNOS、iNOS蛋白表达明显增

2、高，ICAM.1mRNA水平也显著上升。结论:在较短时间内糖浓度升高可引起血管内皮细胞GSH.PX活力下降，ICAM.1mRNA、eNOS和iNOS蛋白表达增高，对糖尿病血管病变早期进展起一定的作用。　　［关键词］高糖;人脐静脉内皮细胞;一氧化氮合酶;细胞间粘附分子1　　糖尿病血管并发症是糖尿病患者死亡的主要原因之一，而内皮细胞损伤是血管病变的基础。长期慢性高血糖与血管并发症的关系十分肯定，但是，短暂的、急性高血糖对血管病变的影响研究不多。本研究观察短期高糖刺激对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞株ECV304的生物学

3、特性的影响，为进一步探讨糖尿病血管病变早期进展的机制提供一定的实验依据。12　　1材料与方法　　1.1细胞、试剂及仪器　　ECV304购自中国科学院上海细胞生物学研究所，DMEM培养液购自Gibco公司，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH.PX）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Triblue试剂购自上海申能博彩公司，引物由上海申能博彩公司合成，RT.PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，兔抗人内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）多克隆抗体购自SantaCruz公司，PowerVisionT

4、M二步法免疫细胞化学检测试剂购自北京中山生物技术有限公司，数码摄像机及图像分析仪购自日本尼康公司。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养及分组取在含10%小牛血清的低糖DMEM培养液中贴壁生长良好的对数生长期ECV304细胞，以每孔2×105个细胞总数接种到6孔培养板，待细胞生长达50%～60%，用无血清DMEM培养液培养24h，使细胞处于静止状态，此时设为0h，然后加入不同处理因素随机分为2组。（1）对照组（C组）:用低糖DMEM培养液，葡萄糖终浓度为5.5mmol・L-112;（2）高糖组（HG组）

5、:用高糖DMEM培养液，葡萄糖终浓度为25mmol・L-1。分别于12、24、36h收上清液测GSH.PX活力，收细胞测ICAM.1mRNA水平。每组同时设4个复孔。　　1.2.2细胞上清液GSH.PX活力测定按试剂盒说明操作，采用二硫对二硝基苯甲酸（DTNB）直接显色法，在412nm处测定吸光度，计算GSH.PX活力值。　　1.2.3细胞总RNA的提取按照Triblue产品说明提取RNA。甲醛凝胶电泳测定RNA的完整性。提取的RNA用紫外分光光度仪（HITACHIu.2001型）分别检测260、28

6、0nm吸光度，并求出A260.A280，结果示所提RNA比值在1.8～2.0之间，说明纯度符合要求。　　1.2.4RT.PCR引物碱基序列参考文献［1］报道。ICAM.1:上游5′.CCGAGCTCAAGTGTCTAAAG.3′，下游5′.TGCCACCAATATGGGAAGGC.3′，扩增片段长度为369bp;β.actin:上游5′.CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT.3′，下游5′.GTTTTCTGCGCAAGTTAGG.3′，扩增片段长度531bp。用AMV逆转录成cDNA，反应条件:42℃60m

7、in，95℃10min;合成的cDNA用β.actin引物扩增作为内参照进行ICAM.1的扩增，反应条件:94℃预变性2min;94℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃12延伸1min，共进行35个循环;最后72℃延伸7min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，用FR.200生物电泳图像分析系统（上海复日科技）进行凝胶扫描，运用Smart-view软件分析产物光密度，并以同一标本的β.actin校正作相对量分析。　　1.2.5细胞eNOS和iNOS蛋白表达的检测和图像分析按上述条件培养、刺激细胞，但

8、种板前预先在6孔培养板板孔内铺设0.5cm×0.5cm的小玻片3～5块，于24h取出玻片，用预冷丙酮固定10min，晾干后用中性树胶粘于载玻片上，4℃保存备测。免疫细胞化学法测eNOS和iNOS蛋白表达，操作均依照试剂盒说明进行，即:3%H2O237℃孵育5min，eNOS和iNOS一抗（1∶50）37℃孵育1h，PBS冲洗3次后加羊抗Ig抗体.HRP多聚体