构建重组杆状病毒的新方法及杆状病毒p74基因种属特异性研究

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1、中山大学博士学位论文构建重组杆状病毒的新方法及杆状病毒p74基因种属特异性研究姓名：吴无畏申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王珣章2003.6.6构建重组杆状病毒的新方法及杆状病毒p74基因种属特异性研究要无畏导师：壬逡章教授专业：生物化学姆分子生物学摘要专千状病毒作为一种广泛瘢用于蛋白表达萃日生物防治的工具得至4了人们的霪视。本文报道了一种利用大肠杆菌ReeA基因介导的嗣源重组机制，程大肠杆菌中快逮构建重组援状痪毒戆赣方法。与揍统懿褐建蘩缀抒状痰毒戆熬转染法楣比，该方法无须空斑纯化等烦琐

2、的过稷，因此愿加简便和快速，同时，利用该方法，入察还霹获褥鞋麓荚转染法无法获褥秘释获瘸毒癸须基嚣酸失拣，鼓露秃这些必须基因的功能研究提供了方便。用该方法构建一个重组杆状病毒仪须一到两个星期。1997年，Yang簿在研究如何修饰细蔚人工染色体(BacterialArtificialChromosomeBAC)时，首次利用大肠杆菌ReeA基因可以介尊同源重组的功能，通过耀温度和双抗生豢戆交蛰筛选，巧妙地竞成了对BAC中丈片段DNA的改造。2001年，Laliofi等又对该方法进行了优化，将原来与欲修饰基因片段在同

3、一令矮粒土懿ReeA鍪因分裹建寒，羧麦覆越pDF25提供，滋减少RecA蛋叁在大肠杆菌中的寝达时间，增加BACDNA的稳定性。本文在此旗础上进一步改进了该方法，逶遥缮热一步傻蘑攀一抗雯素霸溢度静筛逸，大夫簿低了藤方法经瘸温度和双抗生素筛选时的背擐菌落，从而省去了原方法中必须要用PCR藏Southern杂交来验证藏整合予这一步，因而更加简便。一(本文首次将改进露的方法应用子熏组杆状病毒盼构建。逯过该方法构建了四个萤组杆状病毒并利用它们研究了杆状病毒p74基因的种属特异性，p74基因是挺羧痍毒在窭然爨中透过口l爱

4、方式健疆赝盛须豹基壤，了孵它豹穆壤特巽挫蠢助于研究开发扩大杀虫谱的杆状病毒杀虫剂，同时此研究也是杆状病毒入侵机理基础研究中的重要环节。在本文构建的四个重组瘸毒中，AcMNPVBacmid-polhAp74无p74基基，AcMNPVBacmid—polhSL74含SpltMNPVp74鏊因，AcMNPVBacmid-polhAS中p74基因是AcMNPVp74基因膜外区和SpltMNPVp74熬因膜肉蘸静嵌舍傣，AcMNPVBacmid-polhSA中p74纂弱是SpltMNPVp74基因膜癸^／区和AcMNP

5、Vp74藻因膜内区的嵌合体。y擘经生物测定缩渠显示，AcMNPVBacmid-polhSL74兹法通过口服方式感染AcMNPV敏感昆虫银纹夜娥，谠噬SpltMNPV芦搿基因无法替代AcMNPVp74基阂功能，即p74基因戥有种属特异性。同时，AcMNPVBacmid．polhAS、AcMNPVBacmid-polhSA凌无法逶避日摄方式感染镶纹瘦皴，表赘p74基爨熬释属特异性既包含了p74基因膜外区，又包含了膜内区。关黼璧组秆状满R融基鼢影源觐蜊掘种属特姚NewMethodofConstructingReco

6、mbinantBaculovirusandStudiesOiltheSpeciesSpecificityofBaculovirusp74GeneWuWu．WejSupervisor：ProfessorWangXun-zhangMajor：BiochemistryandMolecularBiologyAbstractInsectbaculovirusisadoublestrandedDNAviruswidelyusedasabiologicalpesticideandaeukaryoticgeneexpress

7、ionvector．However,duetothelargesizeofbaculoviralgenomes，itisverydifficulttomodifybaculovimsthroughsimplerestrictionenzymedigestionandligation．Theconventionalcotransfeetionmethodofobtainingtherecombinantbaculovirusisverytimeconsumingandusuallycostmonthstoget

8、adesiredrecombinant。HerewedescribeanewmethodtoconstructarecombinantbaculovirusintheE．colithroughRecAmediatedhomologousrecombination．Thismethoddoesnotneedtoperformtheplaquepurification，whichmustbedonewh