淋巴细胞培养与分离

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淋巴细胞的分离与培养杨星 淋巴细胞的分离人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 外周血红细胞粒细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.0011.092密度分类（PBMC） 密度梯度离心法原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 （一）Ficoll分层液法Ficoll为合成性蔗糖聚合物的商品名，无毒，但高浓度溶液往往不等渗，且粘性高，易使细胞聚集。组成：2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1份泛影葡胺生理盐水Ficoll分层液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳。别名：淋巴细胞分离液 实验方法1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2） 3.20℃，1500r/min，离心30min1500rpm,20℃,30minPBMC红细胞、粒细胞稀释的血浆、血小板FicollFicoll 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。5.加足量稀释液充分洗涤，1800r/min离心10min，弃上清。6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。7.适量的培养基重悬细胞，计数。分离单个核细胞纯度为95%。淋巴细胞约占90%～95%。 （二）Percoll分层液法1、一种连续密度梯度离心分离法。2、主要成分：硅胶颗粒，其大小不一，经高速离心后形成连续密度梯度。 PBMC悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细胞和血小板。那么怎样获得高纯度的淋巴细胞及其亚群呢？ 淋巴细胞及其亚群的分离(一)红细胞的去除一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。(二)血小板的去除将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。 (三)单核细胞和粒细胞的去除1．粘附去除法原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。优点：简便易行，对细胞损伤极少。缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 2．羰基铁粉吞噬法原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3．苯丙氨酸甲酯去除法❈原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。❈用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。❈该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 （四）、淋巴细胞亚群的分离原理：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。常用方法：（1）E花环分离法（2）尼龙纤维分离法（3）流式细胞术（4）磁珠分离术（5）亲和板结合分离法 (1)E花环分离法原理：人类T细胞表面上有能与绵羊红细胞相结合的受体（E受体，CD2）,能与经溴化二氨基异硫基异硫脲氰化物（AET）处理的绵羊红细胞结合，形成稳定的、细胞体积和比重较大的E花环。方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加入分层液→T细胞形成E花环而沉于管底→悬液中为B细胞。 E花环 （2）尼龙纤维分离法原理：B细胞在37℃时易粘附于尼龙棉（聚酰胺）纤维上，而T细胞不具此能力。方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管→洗脱下来的是T细胞。 （3）流式细胞术又叫荧光激活细胞分离仪(nuorescenceactivatedcellsorter,FACS)法原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴(4000个/s)，每小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。 激发系统细胞分选系统荧光激活细胞分离仪分离法检测与讯号处理系统细胞流动系统及气压流速控制系统 流式细胞分析仪 （4）磁珠分离术磁珠分离术是将磁性材料颗粒表面进行外理，微球的核心为小金属颗粒，核心处包裹高分子材料（聚苯乙烯），可结合不同的生物大分子物质（抗原、抗体、核酸等），若微球表面包被有免疫物质则称为免疫磁珠，其兼有免疫配基的性质和磁响应性质，即在磁场中显示磁性，移出磁场时磁性消除。目前商品出售的磁珠有直径为1～5um等不同的规格，表面活性基团有氨基（－NH2）、羧基（－COOH）和羟基（－OH）等。包被的免疫物质有：一抗、二抗等。 方法：将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应的细胞结合成：细胞－抗体－磁珠复合物，该细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。如采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出来。再将该柱移出磁场，与磁珠结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离目的。 单克隆抗体CD3羊抗鼠修饰磁球Biomag抗CD3磁球磁球结合T细胞加入B和T细胞中负向选择正向选择磁架进行分离直接法对细胞进行分类间接法对T细胞进行分离 免疫磁珠法细胞分选过程 免疫磁珠细胞分选装置 （5）亲和板结合分离法原理：各种淋巴细胞亚群具有不同的抗性。①分离CD4+或CD8+细胞，可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。②分离B细胞用抗Ig抗体。③分离有C3受体的细胞用活化的C3包被。 将相应抗体结合于塑料平板上抗原阳性的细胞与相应抗体结合 淋巴细胞的保存和活力测定1、分离细胞的保存（1）短期保存用含有10～20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640培养液可保存数周。 （2）长期保存及复苏保存：在保护剂二甲基亚砜中于液氮（-196℃)中保存。其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内，立即放入降温过渡站(-80℃)中，继而进行降温(-196℃)冷冻。复苏：将其从液氮中取出，立即放入40℃温水中，融化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。 2、细胞活力的检测常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝色）。 淋巴细胞的培养正常情况下，人外周血中是没有分裂相细胞的，只有在异常情况下才能发现。外周血淋巴细胞一般情况下处于增殖期中的G1期，未经培养的外周血中很难找到正在分裂的淋巴细胞。植物血细胞凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，能使处于G1期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有PHA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，加之，淋巴细胞遍及全身，并在所有器官组织中不断循环，能反映个体整体水平情况而不象体细胞那样具有局限性。 培养条件1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件，也是实验成功与否的先决条件。收获细胞前的所有步骤都要保持高度的无菌，严防细菌和病毒的污染。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。 2、恒定的温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36．5±0．5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。如果温度高于37℃，细胞的生长速度减慢；如果温度高于40℃，细胞受损，超过43℃，则导致细胞死亡。培养箱的温度应严格控制在37±0.5℃，为了能精确有效的控温，在普通的隔水式恒温培养箱上可加装一个电子控温仪。若温度过高或过低，则会延缓分裂周期，造成收获时细胞分裂相减少。 3、气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有02和C02。C02既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，他在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2～7.4，培养基的pH值也应调整到7.2～7.4之间，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。偏酸时细胞发育不良，偏碱时细胞会出现轻度固缩。细胞培养液pI-I的调节最常用的为加NaHCO，的方法，因为NaHCO3，可供C02，但C02易于逸出，故最适用于封闭培养。 4、培养液RPMI1640培养基、培养用无机盐、胎牛血清(FCS)、HEPES、肝素、淋巴细胞分离液、植物凝集素(PHA)和白细胞介素等。植物凝集素(PHA)是体外淋巴细胞培养成败的关键，只有在PHA的作用下才能进入有丝分裂，因此要考虑它的质量和尝试，质量有问题药效会降低，浓度过高可能会导致红细胞凝集，都会造成实验效果差。 操作步骤1、洗涤将收集到的淋巴细胞集中于离心管中用培养液洗涤两次，分别以2500和2000rpm离心各10min，弃上清，之后进行接种。2、细胞接种细胞接种通常是在无菌室超净工作台内的酒精灯火焰区进行。接种时无菌操作是否规范，直接影响到细胞培养的成败。如接种时如不慎将手接触到培养瓶的瓶塞，或接触了注射器的针头，可能会造成细菌中霉菌的污染。接种操作是在酒精灯附近进行，接种时还应注意避免高温破坏。操作时手与酒精灯的距离以火焰不烫手为宜，离火焰太近，细胞可能被破坏，甚至被烧焦成块，肉眼可见呈团块；同时也会造成针头堵塞。出现这种情况，应及时更换针头。如已接种，应更换一瓶培养液。 3、摇床培养将接种后的培养瓶放于CO2培养箱中培养，条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。从72h开始每48h添加等体积的新鲜培养液。 注意事项一、严格无菌操作对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。二、血清的选择淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。血清浓度在5%～20%时细胞生长比较好,当超过30%时反而不利于细胞生长。 三、pH值细胞生长的最适pH为7.0～7.2,可忍耐的pH范围为6.6～7.8,当pH低于6.8或大于7.6时,都会抑制细胞生长。RPMI1640培养基加入血清后pH值一般升高0.2～0.4,故配1640培养液及其他用液时使pH值达到7.2比较合适,并且需经常检测pH值。四、培养空间培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10为宜,培养液液面高度最好维持在2～5mm的范围,以便于气体交换。五、恒温培养箱温度应维持在37℃,CO2浓度为5%,O2为95%,100%的饱和湿度。 常见失败原因1.污染污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响较小,尤其只培养72小时。一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染2.pH值　过高或过低,或培养过程中瓶塞不紧,CO2逸出,导致pH值上升。3.诱导剂  淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)、白细胞介素2(IL-2)、植物血凝素(PHA)、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。须注意它们的浓度及是否失效。4.培养器皿洗涤不干净有蜡、油污或酸残留 5.培养用液含有杂质　配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水,若含有Fe、Ca等离子及杂质,可影响细胞的增殖。6.接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞中混有大量红细胞。7.血清质量不佳。8.恒温培养箱的CO2、温度等不稳定。9.存在个体差异　在相同条件下,某一受试者的血培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法查出.淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关,青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。 人体外周血淋巴细胞培养技术是自20世纪60年代初发展起来的一种细胞培养技术，通过此技术在细胞遗传学方面的应用，可以用作诊断许多由染色体异常而导致的遗传性疾病，直至目前仍然作为基层临床诊断染色体疾病的主要手段之一。利用体外培养的淋巴细胞还可进行抗癌研究、爱滋病治疗、新药研制。 谢谢大家