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1、北方园艺2010(19):145~148生物技术杏叶片DNA提取和荧光AFLP反应体系的建立张俊环,孙浩元,杨!丽,王玉柱(北京市农林科学院林业果树研究所,北京100093)!!摘!要:以杏嫩叶为材料,利用改进的CTAB法,提取到高质量的杏叶片总DNA,通过优化酶切、连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,建立了高效稳定的杏荧光AFLP反应体系;筛选出多态性好的12对引物组合,均获得稳定、清晰的扩增图谱,可进行杏品种鉴定、种质资源的遗传多样性和亲缘关系分析等研究。关键词:杏;DNA提取;荧光AFLP标记中图分类号:S662.2;Q943.2!文献标
2、识码:A!文章编号:1001-0009(2010)19-0145-04!!杏是中国原产果树品种之一,有着悠久的驯化栽培1!材料与方法历史和广泛的分布地区,种质资源极为丰富,我国拥有1.1!试验材料世界三分之二的品种和类型,对这些品种资源的遗传背试材取自北京市农林科学院林业果树研究所杏种景进行分子水平的研究,将为有效地利用现有资源进行质资源圃。取正常生长的幼嫩叶片,用冰壶带回实验品种改良、挖掘优异基因,并最终为育种和生产服务提室,液氮速冻后置-80∀冰柜保存备用。供了一条新途径。已有的研究表明,分子标记技术是研1.2!叶片DNA的提取究植物遗传多样性
3、与亲缘关系,从而对品种资源合理利称取材料50mg,液氮研磨成粉末,迅速转入盛有用与保护的有利工具。扩增片段长度多态性(AFLP)是800L2%CTAB提取缓冲液(100mmol/LTrisCl,pH继RFLP、SSR、RAPD之后发展最快的DNA分子标记8.0,20mmol/LEDTA,1.4mmol/LNaCl,2%(W/V)技术,该技术结合了RFLP的稳定性和RAPD技术的简CTAB)的2mL离心管中,加入0.016gPVPP和20L便高效性,同时又能克服RFLP带型少、信息量小以及巯基乙醇,剧烈振荡混匀,60∀预热40min,其间混
4、匀[1]RAPD技术不稳定的缺点,并且和SSR相比,AFLP无2~3次,取出样品于室温放置,待样品冷却到室温;加入需事先知道DNA序列,免去了SSR标记中引物设计的800L氯仿#异戊醇(24#1),振荡混匀,12000r/min麻烦,因此成为目前较为理想的分子标记技术,已在果离心15min,取上清液到2mL离心管中加入1.5倍体[2][3]树分子遗传连锁图的构建、品种鉴定、种质资源遗传积1∃CTAB沉淀液(50mmol/LTrisCl,pH8.0,[46][7][89]多样性分析、亲缘关系研究、分子标记辅助育种10mmol/LEDTA,1%
5、(W/V)CTAB,20mmol/L巯基等领域得到了广泛的应用。但是,目前有关杏的AFLP乙醇),放置20~30min,12000r/min离心15min,将沉分析的报道较少,且未曾见杏AFLP反应体系方面的研淀晾干,溶于200LTEbuffer,加入400L95%乙醇,究。因此,该研究以不同来源的杏种质资源为试材,探20L3mol/LNaAC,-20∀沉淀1h,4∀下12000讨用常规的CTAB法制备DNA模板以及建立适合杏基r/min离心15min,弃上清,用75%乙醇洗沉淀2次;室因组荧光AFLP分析的技术体系,旨在为相关的遗传分
6、温干燥DNA沉淀;用4∀50~100LTE溶解,-20∀析奠定基础。贮存备用。1.3!DNA的质量检测1.3.1!DNA紫外吸收值!取10LDNA溶液用TE第一作者简介:张俊环(1974),女,山东菏泽人,博士,副研究员,现主要从事果树分子生物学研究工作。Email:zhang_junhuan@稀释至500L,在EppendofBiophotometer6131型仪器163.com。上检测DNA的浓度及纯度。通讯作者:王玉柱(1960),男,北京平谷人,博士,研究员,现主要1.3.2!DNA的电泳检测!取5LDNA样品,加2L从事果
7、树资源与育种技术研究工作。荧光标记的溴酚蓝上样缓冲液;以MarkerDNA/Hind基金项目:北京市自然科学基金重点资助项目(6081001);国家十%为标准于0.8%琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像仪拍照,一五科技支撑计划资助项目(2008BAD92B02);国家十一五公判断DNA分子量大小及完整程度。益性行业科研专项资助项目(200904032)。收稿日期:2010-06-02145生物技术北方园艺2010(19):145~1481.4!AFLP反应体系的建立ng/L,OD280/OD260比值介于1.78~1.92之间,表明1.4.1!酶
8、切连接各样品基因组DNA的酶切和接头的DNA较纯,RNA去除完全,没有蛋白质及酚等物质污连接在同一反应中进行!在20L反
