柱花草AFLP反应体系的建立与引物筛选-论文.pdf

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1、2014年4月热带农业科学第34卷第4期Apr．2014CHINESEjouRNALOFTROPICALAGRICULTUREVo1．34，No．4柱花草AFLP反应体系的建立与引物筛选①韩蓉蓉，2)②曾黎琼史亮涛∞刘国道何光熊。文亦芾)③金杰(1云南农业大学动物科学技术学院云南昆明650201：2云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所／-X-南省农业生物技术重点实验室／农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室云南昆明650223：3云南省农业科学院热区生态农业研究所云南元谋651300：4中国热带农业科学院热带作物品

2、种资源研究所海南儋州571737)摘要以柱花草奥克雷品种为材料．采用改良的CT^J3法提取基因组DNA．对影响AFLP反应体系的主要因素进行了优化，建立了柱花草的AFLP反应体系。结果表明：20L为最佳反应体系，酶切体系中DNA模板量为1000ng，用5UoRI37℃酶切2h、5UMseI65℃酶切2h效果最佳；分别取5酶切液、1T4连接酶(5p~L／L]l、1EcoRI接头、1胍eI接头、2L缓冲液(T4DNA酶自带)，于22℃下连接10min效果最佳；预扩增体系中模板稀释15倍、Mg浓度为O．75mmol／L、Taq酶

3、用量为1U、dNTPs浓度为0．2mmol／L、引物浓度为2ng／p~L效果最佳；选择扩增体系中模板稀释2O倍、Mg浓度为1．25mmol／L、Taq酶为1U、dNTPs浓度为0．225mmol／L、引物浓度为O．4ng／IxL效果最佳。利用热研5号、奥克雷2个品种对8对引物组合进行筛选，筛选出46对引物组合．为利用AFLP标记对柱花草进行分子生物学研究及分子育种奠定基础关键词柱花草；DNA；AFLP；引物筛选分类号$541EstablishmentofAFLPReactionSysteminStylosanthesgui

4、anensiasandItsPrimerSelectionHANRongrong’-ZENGLiqiongSHIUangtao~LIUGuodaoHEGuangxiong曲WENYifei’JINJie：∞(1CollegeofAnimalScienceandTechnology，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming，Yunnan650201；2BiotechnologyandGeneticGermplasmInstitute／YunnanProvincialKeyLabofAgricu

5、lturalBioteehnology／MinistryofAgricultureKeyLabofSouthwesternCropGeneResourceandGermplasmInnovation，YunnanAcademyofAgriculturalSciences，Kunming，Yunnan650223；3ResearchInstituteofTropicalEco--agri[cultureSciences，YunnanAcademyofAgriculturalSciences，Yuanmou，Yunnan651

6、300；4TropicalCropGeneticResourcesInstitute，CATAS，Danzhou，Hainan571737)AbstractExtractthetotalDNAofStylosanthesguianensisusinganimprovedmethodofCTAB．TheStylosanthesguianensisAFLPsystemwasestablishedanditsprimerswereselectedforanalysisbyoptimizingthemainfactorsafect

7、ingtheAFLPsystem．TheresultsindicatethattheAFLPoptimumconditionsforrestrictionenzymedigestionoftheStylosanthesguianensiswereasfollows：1000ngDNA①基金项目：国家自然科学基金(No．30960266；No．31160481)；农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室开放基金(No．KFKT：2010l1)。收稿日期：2014一O3一-05；责任编辑／林海妹；编辑部E-maii：rdnk@

8、163．aom。②韩蓉蓉(1988~)，女，硕士研究生，主要研究方向为草地(草坪)与环境；E-maii：198912l4rong@163．com。③通讯作者。E-mail：yifeiw2o05@yah0o．com．cn。一46—韩蓉蓉等柱花草AFLP反应体系的建立与引物筛选template，5UEcoR