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《高效液相色谱_同位素稀释质谱法测定血清中苯丙氨酸》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第26卷增刊分析测试学报Vo.l262007年9月FENXICESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis)Sep.2007高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定血清中的苯丙氨酸武利庆,王晶(中国计量科学研究院生物能源环境所,北京100013)苯丙酮尿症(PKU)是一种世界性分布的遗传疾病,病人体内缺少苯丙氨酸羟化酶(PAH),导致苯丙氨酸(Phe)不能正常代谢为酪氨酸,引起Phe代谢产物在人体中过量蓄积,造成患者中枢神经系统受到不可逆的损害而影响智力。但是该病若在早期发现并给予积极治疗,患者
2、智力发育可以完全正常,[1]因此血清中苯丙氨酸含量测定对于PKU的诊断和治疗具有十分重要的意义。Phe的检测方法有多种,主要有细菌抑制法、荧光法、气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)[24]等,但是这些测定方法存在易受复杂血清基体的干扰,可能存在系统误差、结果精度低等问题,因此不能作为基准方法。同位素稀释质谱法由于能够最大限度减少基体物质对测定结果的影响,大大提[5]高结果的准确度和精密度,成为各国计量机构研究的重点之一。1995年国际计量委员会(CIPM)下的物质量咨询委员会(CCQM)决定将同位素稀释质谱方
3、法列为5个化学测量基准方法的首位,用于开展化学计量溯源性研究。本文利用同位素稀释质谱法对血清中的苯丙氨酸进行了测定,5次重复分析的相对标准偏差仅为05%,并且测定结果可以通过Phe标准物质直接溯源到SI单位,该方法可用于我国血清苯丙氨酸标准物质的定值及溯源体系的建立。1实验部分11仪器及试剂乙腈(色谱纯,德国Merck);全氟庚酸、三氟乙酸(美国Sigma公司);苯丙氨酸标准物质(纯度992%16%)、人血清样品(中国计量科学研究院化学所);D8标记苯丙氨酸(美国剑桥同位素实验室)、盐酸(优级纯,北京化学试剂公司);咖啡因、MRF
4、A四肽、Ultramark1620;实验用水都经MilliQ纯水系统纯化。液相色谱质谱联用仪(ThermoFinniganLTQ),台式离心机(Sigma3K15),漩涡混合器(MS2Minishaker),移液器(Gilson),天平(SatoriusME235S,001mg感量;MettlerToledoUMX2,01g感量)12样品处理称取25mg苯丙氨酸或苯丙氨酸的同位素标记物,分别溶于10mL1%甲酸-水中,配制成储备液,使用时用1%甲酸-水稀释10倍后使用。根据HPLC测定的血清中苯丙氨酸含量,在血清样品中添加等量的
5、苯丙氨酸同位素标记物,2000r/min离心2min,在4冰箱中放置24h后使用。取添加有同位素标记物的血清,室温下平衡1h,加入等体积的乙腈沉淀蛋白,3000r/min离心10min后取上清,转移到安培瓶中用高纯N2吹干。残渣用1%甲酸-水复溶,经045m滤膜过滤后用于液质联用分析。同时配制苯丙氨酸含量与血清中苯丙氨酸含量接近,但是苯丙氨酸与标记苯丙氨酸质量比值约为095和105的标准溶液,经045m滤膜过滤后用于液质联用分析。进样时按照低标-样品-高标-样品-低标的顺序重复分析。13色谱条件与质谱条件使用Aglient的SB
6、AqC18250!46mm色谱柱,柱温250,每次进样10L。流动相A的组成为含有08mmol/L全氟庚酸和005%三氟乙酸的水,B为乙腈,在20min内由100%A变成40%A,流速为04mL/min。质谱仪喷雾电压45kV;壳气流速30arb;辅助气流速5arb;干燥气温度300;归一化碰撞能量33。采用多反应监测模式(MRM),分别监测苯丙氨酸(m/z166∀120)和标记苯丙氨酸基金项目:科技基础条件平台资助项目作者简介:武利庆(1978),男,河北赞皇人,助理研究员,博士,Te:l010-64276678,E-mai
7、:lwulq@nimaccn#98#第8期分析测试学报增刊(m/z174∀128)的质谱信号。14血清中苯丙氨酸含量的计算血清中苯丙氨酸含量按下面的公式计算:c={Pm标[R样(I1-I2)-(I1R2-I2R1)]}/[m(R1-R2)],其中:m标为血清中苯丙氨酸同位素标记物的质量,R样为样品苯丙氨酸与苯丙氨酸标记物的峰面积比,I1为高标溶液中苯丙氨酸与苯丙氨酸标记物的质量比,I2为低标溶液中苯丙氨酸与苯丙氨酸标记物的质量比,R1为高标溶液中苯丙氨酸与苯丙氨酸标记物的峰面积比,R2为低标溶液中苯丙氨酸与苯丙氨酸标记物的峰面积
8、比,m为血清质量,P为苯丙氨酸标准物质的纯度。2结果与讨论21血清中游离苯丙氨酸的同位素稀释质谱测定同位素稀释质谱的典型质谱图见图1所示。根据测
