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《不同核酸提取法对HCMV_DNA准确定量的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、上海交通大学学报(医学版)Vo.l26No.10Oc.t2006JournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience)!1193!文章编号0258-5898(2006)10-1193-03!实验研究!不同核酸提取法对HCMVDNA准确定量的影响张,方风琴,钱春艳,季育华(上海交通大学医学院瑞金医院临床实验诊断中心,上海200025)摘要目的评价不同核酸提取法对人巨细胞病毒核酸(HCMVDNA)荧光定量PCR准确定量的影响。方法含HCMVAD169株病毒颗粒的病毒培养物
2、,以不同浓度分别与10份健康人HCMVDNA阴性血浆标本混合;另取15份临床移植患者HCMVpp65抗原血症阳性血浆样本,上述2种标本分别用碱裂解吸附法、沉淀煮沸裂解法和酚-氯仿抽提法提取病毒核酸模板,随后运用荧光定量聚合酶链反应对样本进行定量分析,并作评价。结果15例临床检测阳性血浆标本中,酚-氯仿法提取效率为最高(P<0.05),换算后其相对提取效率为100%,而沉淀煮沸裂解法为90%,碱裂解吸附法为65%;此外,沉淀煮沸裂解法和酚-氯仿法的重复性均好于碱裂解吸附法,变异系数(CV)值分别为0.26、0.30和0.39
3、。结论经典、传统的酚-氯仿抽提法仍不失为实验室首选的核酸提取方法。关键词核酸;荧光定量PCR;人巨细胞病毒中图分类号Q503;Q52文献标识码B血浆中人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,胞(humanembryolungfibroblas,tHELF)(本室保HCMV)核酸的准确定量检测,在HCMV潜伏激活感存);病毒核酸吸附柱(上海生工);HCMVDNA荧光[1]染患者的治疗监测中具有极其重要的意义。由于定量PCR试剂盒(深圳匹基生物技术公司);DMEM血浆中HCMVDNA含量较白细胞中的
4、低(尤其在培养基(Gibco);Lightcycler实时荧光定量PCR仪[2]HCMV潜伏激活的早期),因此,为了提高检测的(Roche);离心机(Beckman)。灵敏度,选择一种检出率高、简便、快速的样品处理实验方法方法,对临床实际应用具有重要意义。1.HCMV病毒颗粒的获得:将HCMVAD169标影响PCR定量准确性的因素,除其本身的反应准病毒株感染HELF14d后,细胞病变达80%时,经全过程外,还有一个重要环节,就是样本的前处理,超声破碎,使病毒颗粒游离,14000∀g离心10min即病毒DNA的提取。本文采用已知
5、拷贝数的HCMV除去细胞碎片后将上清用PBS重悬,作为HCMV病[3]病毒颗粒的血浆样本作为内参照,与另外15份临毒颗粒悬液。经HCMVDNA荧光定量检测初步定9床样本(HCMVpp65抗原血症阳性)一起同步采用量得到病毒拷贝数为10拷贝/mL,分装后-80#3种不同的核酸提取法抽提病毒核酸,并进一步完成保存。荧光定量PCR反应,评价不同核酸提取法对HCMV2.混合样本的制备:取10例HCMVDNA阴性DNA准确定量的影响。血浆样本分别与一定量的上述HCMV病毒悬液混合,每份血浆样本配制成6份含不同病毒浓度的样材料与方法
6、本。具体步骤:分别取0.001、0.01、0.1、1和10L的上述HCMV病毒悬液,其相应的HCMVDNA拷贝实验材料健康成人HCMVDNA阴性血浆标234567数分别为10、10、10、10、10、10拷贝/mL,与本10份;本院临床造血干细胞移植及肾移植患者病HCMVDNA阴性的血浆样本混合,使每份混合样本毒核酸(HCMVDNA)拷贝数未知的阳性血浆标本的终体积为100L,以此作为内参照样本;15份患者15份;HCMVAD169标准病毒株和人胚肺成纤维细血浆阳性样本也取100L;以上每个不同浓度标本基金项目
7、上海市教委科研重点基金(04BA04)和上海市科委重大均准备3份,分别采用3种核酸方法提取病毒核酸。攻关基金(04D219114)资助项目3.标本核酸提取方法:∃碱裂解吸附法:取上述作者简介张(1973-),女,山东荣城人,博士生通讯作者季育华,Emai:lrjjyh@yahoo.com.cn血浆样本(包括混合样本)100L,加入400L碱性!1194!上海交通大学学报(医学版)Vo.l26裂解缓冲液混匀,加入3L蛋白酶K(1%),经55#临床阳性标本的提取效率比较临床上血浆保温5min后加入260L无水乙
8、醇,移入吸附柱,洗HCMVDNA定量结果阳性率较低,为了得到具有可涤2次,以30L洗脱液洗脱后-20#保存备用。比性的检测结果,本文选取了15例临床检测HCM%沉淀煮沸裂解法:取血浆样本100L加入等量Vpp65抗原血症阳性血浆作为检测对象,用以对3种15%PEG600
