《Sanger法测序》PPT课件

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1、Sanger法测序--在HLA-SBT分型中应用2009.10杨华志唐金凤胡志锋周巧云杨晓琴目录HLA的介绍测序原理—Sanger法测序测序反应操作流程及注意事项简单的峰图分析HLA的介绍为什么要进行HLA检测HLA是迄今为止发现的多态性最高的基因系统之一，它与同种异体器官移植的排斥反应密切相关，而且该基因的高度多态性在法医学上的亲子鉴定、个人识别以及疾病相关性和人类进化研究方面也起着重要作用。HLA配型在器官移植中是必要的。HLA的相容性程度（配型的符合程度）是决定移植物长期存活的主要因素之一。HLA的

2、介绍HLA分型1、血清学分型2、细胞学分型3、DNA分型①PCR-RFLP技术②PCR-SSO技术③PCR-SSP技术④PCR-SBT技术HLA的介绍PCR-SBT:以PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。SBT法HLA高分辨分型已逐步在欧美国家推广，并成为“金标准”。目前我们华大也以SBT法为主，并结合SSP方法进行HLA的配型。HLA的介绍PCR-SBT法分型的基本流程HLA的介绍back测序原理双脱氧链终

3、止法（Sanger法）：1977年，英国人FredSanger发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。脱氧核糖核苷酸通过形成3,5-磷酸二酯键延长DNA链5´磷酸3´羟基3´,5´-磷酸二酯键测序原理测序原理测序原理经PCR扩增反应，可以得到一系列长度不同的产物，由于ddNTP带有荧光标记，对产物进行电泳分离，并用相应的仪器进行检测，就可以读出模板的序列。PCR与测序

4、反应的比较PCR测序反应DNA聚合酶Taq酶测序酶引物一对单向底物dNTPdNTP+ddNTP*模板量少质量要求高产物等长的DNA片段长短不一的片段3’端带荧光标记测序原理back测序反应操作步骤实验前准备Mix配制测序引物稀释编板号（日期_S位点_测序引物_纯化板编号_（其它））反应加样短暂离心后上PCR仪预约PCR仪编写测序反应表根据要检测的样品数计算试剂的需要量查看实验所需的耗材是否够用用70％乙醇擦桌面，不能残留粉尘测序反应实验前准备backMix配制Step1：按实验需要的体系和用量计算各组分的

5、加量，冰上或4℃避光缓慢解冻2.5×BigDye；计算公式：1×（V）＝2.5×（VBD）＋5×（VBuffer）其中V＝反应体系体积，通常＝5μl；VBD＝2.5×BigDye体积；VBuffer＝5×Buffer体积Step2：振荡3秒或颠倒5次混匀，离心10秒，冰上或4℃避光保存，当天使用；剩余mix可-20℃保存，避免反复冻融，解冻2次内用完。常用配方：试剂名称每5μl反应体系理论用量模板DNAPCR产物20-50ng；质粒100-200ng引物3.2pmol2.5×BigDye0.5μl0.4μ

6、l0.3μl0.2μl5×Buffer0.75μl0.8μl0.85μl0.9μl超纯水加至5μlMix配制注意事项①对多个使用相同引物的测序反应可以把引物加到mix中②配制mix和稀释引物的millipore水应分别使用；③吸取不同的试剂要换枪头；④试剂打开后应立即吸取并盖好盖子，接触样品的容器、试剂严禁长时间暴露在空气中，时刻防止污染！back引物稀释干粉稀释Step1：按合成报告单上的分装规格计算稀释至所需浓度应加入的超纯水；Step2：将干粉离心12000rpm，2min；Step3：加入一定体积

7、的millipore水后盖好离心管盖；Step4：振荡1分钟，室温放置30分钟，使其充分溶解；Step5：再次振荡30秒，离心10秒。引物稀释液体稀释：根据以下公式计算（通常使用液浓度＝3.2pmol/μL）加水量=(储存液体积×储存液浓度/使用液浓度)-储存液体积按预算的体积在1.5mL离心管中加入millipore水，吸取所需体积的指定引物储存液加入水中，充分振荡30秒，离心10秒，备用。稀释引物注意事项1、引物稀释前要离心，液体引物12000rpm离心30s,干粉引物12000rpm离心2min。2

8、、打开干粉引物离心管盖时动作尽量轻缓，打开的角度不超过45°。3、每次稀释引物前，均需用新的millipore水。4、加水稀释时注意枪头的更换，避免交叉污染。5、稀释完后，将引物的流水号和引物名称一一对应写在新的Ep管上。back反应加样按《测序反应表》将待测样本和测序引物摆放到96试管架上对应位置；移液器调至所需量程；实验用品放在便于操作的位置；测序反应板标记板号后开始加样。按照反应体系加样：每次加完后都要离心一下，检查每个