3730测序(sanger法)常见问题分析(汪大海)

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1、3730测序常见问题分析汪大海深圳华大基因研究院测序结果—峰图(整个序列)测序结果—峰图(chromas)四色图谱每一种颜色对应的碱基峰图分析常用软件•ABI公司配套软件:SequencingAnalysis5.2•ABI公司免费软件:SequenceScannerv1.0•较简单而直观的软件:chromas•商业软件:DNAstar等•……SequencingAnalysis5.2软件峰图分析窗口•电泳图谱Electropherogram窗口峰形是否正常/有无杂带/信噪比/测序长度SequencingAnalysis5.2软件Sequence窗口•原始数据r

2、aw窗口平均信号高度/峰有无变宽/左右峰高是否均衡信号值正常范围：150-1500也可通过SequenceScannerv1.0软件查看怎样判别测序数据的质量?Sequence窗口•BaseQVforeachbaseineachsamplefileElectropherogram窗口•BaseQVforeachbaseineachsamplefileQV=-10×lgpe上面公式中，Pe代表碱基读取的错误概率QV10代表Pe=10%；QV20:Pe=1%；QV30:Pe=0.1%QV40:Pe=0.01%信噪比(Signal/Noise)S/N3%Bkg.No

3、ise307.5%Bkg.Noise1312.5%Bkg.Noise820%Bkg.Noise5影响测序质量的主要因素•DNA模板（关键）•引物•测序试剂•PCR仪•纯化方法预防的要点成功的关键质粒测序¾模板:引物=200ng:3.2pmol¾BigDyebuffer终浓度保持1×PCR产物测序¾PCR产物测序前一定要经过纯化¾PCR产物稀释后再测序¾记住电泳鉴定判断有无杂带案例分析•引物问题•模板问题•纯化影响•毛细管寿命与电泳•困难模板一、引物问题●现象：每个峰后面有个●现象：每个峰前面有个同样荧光信号的小“尾巴”。同样荧光信号的小“尾巴”。●原因：合成时

4、引物多一●原因：合成时引物多一个碱基。个碱基。●对策：重新合成引物●对策：重新合成引物––引物（模板）不纯●现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰）●原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质●对策–建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE纯化的测序引物。–脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。引物二聚体●现象–前面100多bp噪音高，后面正常●原因–引物二聚体未去除干净●对策–割胶纯化模板上没有引物结合位点双引物结合从一开始（区别于非单克隆）就出现两套峰可能原因：模板有两个引物结合位点，同时和两个引物结合二、模板问题PCR产物PC

5、R正常终止PCR正常终止后面的噪音峰终止峰两套模板非特异PCR产物●现象每个峰下面都有其它颜色。●原因PCR主带与杂带混在一起测序。●对策•凝胶电泳回收主带，重新测序非单克隆●现象–左边清晰干净；右边全部双峰，且信号强度比左边低一倍。●原因–挑克隆时两个不同的菌落混在一起。●对策–重新挑单克隆，重新提取质粒。三、纯化影响染料和酒精峰一般看到的染料峰染料峰不影响其它序列的可靠性轻微荧光污染•●现象•荧光污染但不干扰原有的峰（透明）。•●原因•可能带有苯环结构的有机分子掺入，如记号笔污染等。●现象荧光物质污染–红色峰异常高。●原因–未知大分子荧光物质污染，恰好是红

6、色，被软件误认为红色峰。●对策–依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。●现象钉子峰–四色并存突然拔起的尖峰，峰形锐利。●原因–毛细管内有气泡、灰钉子峰尘、尿素结晶等，对激光全反射。●对策–灌胶时，避免气泡产生；–上样前，样品先离心；–毛细管、检测窗口保持清洁；–胶内有尿素结晶时，注意不要吸进注射器；–样品纯化干净。“瀑布效应”●现象–基线从高处突然下降。●原因–有机物进入毛细管，受激发产生一定波长的荧光，抬高基线。●对策瀑布效应造成碱基读–依次更换水、缓取错误冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。四、毛细管寿命

7、与电泳毛细管寿命到期：峰的左右不对称，向后拖，有小突起突起部分宽峰●现象–测序峰逐渐变宽。●原因–样品进入毛细管太多。●对策–稀释样品浓度，重新进样。–减少电进样(EKI)时间。还有很多其它的问题•每个影响测序反应和3730正常运行的因素都可能影响到测序进行•包括试剂、耗材、温度、电压等•……困难模板现代测序技术的痼疾：困难模板•●什么是困难模板？•–GC含量太高；•–回文结构、复杂的二级结构等；•–较长的重复序列。•●困难模板怎么办？•–使用高纯度的DNA样品（关键点）•–优化反应条件•–增大试剂(BigDye等)用量以及反应体系根据原始数据判断是否是困难模

8、板信号突然降低特殊结构信号突然降低Po