《DNA提取与保存》PPT课件

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1、不可忽视的细节—血液基因组提取天根生化科技（北京）有限公司DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则内容没有严格要求:PCRSouthernBlotsRFLP严格要求片段长度:构建文库PFGE(脉冲场凝胶电泳)DNALengthDNA提取原则1：DNA片段长度没有严格要求常规PCR严格要求产物纯度存档、产物长期保存Southern杂交荧光定量PCRSNPMicroarrayCGH(比较基因组杂交)DNA提取原则2：DNA产物纯度DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测

2、方法试剂选择原则内容基因组提取方法溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸磁珠法：独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身体健康。DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则内容样本保存和前处理－抗凝血液保存柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使

3、用柠檬酸或EDTA处理血样。加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月；－70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.冻存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。2.抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。样本保存和前处理－非抗凝血保存非抗凝血即血凝块。-20℃保存一个月；-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.冻存的血凝块使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。血凝块前期

4、破碎程度越高，提取基因组就越容易！样本保存和前处理－白膜层保存全血分离得到的白膜层放置-20℃或-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到的沉淀。2.冻存的白膜层使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。3.虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液还是必要的，但用量减半。4.采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即：1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml全血的试剂量。样本保存和前处理－血清/血浆保存现在很多科

5、研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。分离得到的血清/血浆放置-70℃保存。尽量避免样本反复冻融。样本前处理1.冻存的血清/血浆使用前溶解应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。3.只需100-200ul样本，基本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。样本保存和前处理－微量血液/干血点/羊水/胸水保存微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存；干血点：干燥后室温或4℃保存；羊水：-20或-70℃保存。样本前处理1.微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。2.干血点加入缓冲液直接进

6、行提取。3.羊水/胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。样本保存和前处理－口拭子/漱口水保存口拭子：干燥后室温保存漱口水：4℃保存或离心得到沉淀-20℃或-70℃保存样本前处理1.拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。2.有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心得到沉淀再进行核酸提取。3.漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则内容基因组提取流程加入吸附柱缓冲液漂洗DNA洗脱收集样本裂解纯化去蛋白沉淀核酸洗涤去盐溶解

7、DNA沉淀样本裂解溶液法（盐析法）吸附柱法红细胞裂解哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式：采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照3倍全血体积加入进行裂解).采用细胞裂解液进行裂解（TIANGEN的细胞裂解液CL是按照2.5倍全血体积），细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为细胞核沉淀，更方便基因组DNA的提取。红细胞裂解充分的现象：得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votex彻底混匀。核细胞裂解如果有裂

8、红的步骤，请尽量将上清去除再加入裂解液。加入裂解液（如：TIANGEN试剂盒中的GB或FG）和