质粒DNA的提取与检测ppt课件.ppt

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1、质粒DNA的提取及检测薛亚男质　粒（plasmid）是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等质粒的复制：严紧型复制（1~n个）松弛型复制（20个以上）常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18,pUC19Ampr抗性基因Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力质粒提取的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DN

2、A脂类及小分子杂质RNA凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第一部分　质粒DNA的提取目录返回标题一．实验目的二．实验原理附：原理示意图三．试剂四．器材五．注意事项六．操作步骤1六．操作步骤2六．操作步骤3一．目的了解提取质粒的原理。学习和掌握质粒提取的方法和技术。——三个基本步骤：细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒DNA的分离质粒DNA的纯化返回目录二．原理碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在

3、的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。返回目录☆原理示意图返回目录返回原理三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、（三）试剂：LB培养基（液体、固体）溶液I溶液II溶液IIITE(pH8.0)器材1.恒温摇床2.超净工

4、作台3.离心机4.电泳仪和电泳槽5.玻璃器皿与耗材量筒、三角瓶、平皿;EP管(1.5ml,0.5ml);枪头(1ml,0.2ml,10μl);牛皮纸、纱布、牙签等返回目录试剂1.LB培养基detail2.溶液Idetail3.溶液Ⅱdetail4.溶液IIIdetail5.TE(pH8.0)detail返回目录LB培养基back配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/LNaOH(约0.2ml)调节pH值至

5、7.0,加入去离子水至总体积为1L，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。溶液Iback50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液IIback0.2mol/LNaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液IIIback5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L

6、，乙酸根的浓度为5mol/L。作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA0.5mol/LEDTA(pH8.0)在800ml水中加入186.1gEDTA-Na·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0(约20gNaOH颗粒)，然后定容至1L，分装后高压灭菌。1mol/LTris·Cl(pH8.0)在800ml水中加入121.1gTris-base，溶解后加浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，定容至1L，分装后高压灭菌。TE(pH8.0)back10mmol/LTris·Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0

7、)作用：稳定ＤＮＡ四、实验步骤接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5ml菌液入1.5ml的离心管中6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min