考马氏亮蓝法测定豌豆中蛋白质含量

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1、实验八豌豆中蛋白质含量的测定-----考马斯亮蓝G-250法一实验目的1、学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量2、学会自己独立的设计实验二实验原理考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后，在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定

2、。三实验器材旋涡混合器、试管、吸管、722型分光光度计、容量瓶、电子分析天平等。四实验试剂1、9％NaCL溶液。2、标准蛋白母液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml），准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml。3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸，后加蒸馏水定容到1000ml。以上试剂均为国产或进口分析纯。4、标准液：取牛血清白蛋白（0.1mg/ml）溶液，加入0.9%NaCl稀释至一定浓度。5、样品液：精密

3、称量5.0g研磨的豌豆干粉末，加入0.9%NaCl定容至50ml，备用。五实验方法（一）标准曲线的制备1、取6支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。2、混匀，室温静置3min，以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，名标准液浓度（ug/ml）作为横坐标作图得标准曲线。试剂管号1（空白）23456标准蛋白液/mlH2O/ml蛋白质浓度（g/ml）01.000.20.90.020.40.80.040.60.70.060.880.081.00.41.0（二）样品的测定1、样液的制备取制备好的大豆组织样

4、液1.0ml，加入0.9%NaCl定容至250ml，另取一支干净试管，加入样液1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。注意2、含量的测定经计算豌豆的0.0547mg/ml，及蛋白质的68.375%。六注意事项1．研究表明，NaCl、KCl、MgCl2、(NH4)SO4、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂及Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA有少量干扰，

5、可很容易地通过用适当的溶液对照而消除。同时注意，比色应在显色2min-1h内完成；如果测定很严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定吸光度，因为在这段时间内颜色最稳定。2．测定那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料结合量是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。3．待测溶液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100-800ug/ml为宜。七思考题1．Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？答:Bradford法是根据蛋白质与染

6、料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465nm变为595nm,蛋白质在1～1000μg范围内,蛋白质－色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定.可以提高药品的纯度,设置对照,提高实验者的操作水平等来消除干扰,提高实验的精确性和可信度.2.为什么标准蛋白必须用凯氏定氮法测定纯度？答:凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最

7、简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法,其适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，具有有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。估在实验前必须标定标准蛋白的纯度,以确保实验的准确.八、参考文献【1】胡志辉种子蛋白质组分的综合实验设计.江汉大学学报（自然科学版）.第38卷第2期.2010年6月【2】董洁、郭力维等中药水提取液中蛋白质含量测定研究.现代中药研究与实践.2009年第22卷第2期【3】郭颖那、孙卫蛋白质含量测定方法比较.河北化工.2008年04期第31卷第4期【4】郭玉珍,陈庆富.染料结合法测定荞麦种子蛋白质含量

8、的研究.广西植物Guihaia27(6)：952–957【5】食黄婉玉等.考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量品与发酵工业.2009.35(5).160～163【6】郭敏亮,姜涌明.考马斯亮蓝显色液组分对蛋白质测定的影响.生物化学与生物物理进展.1996.23(6)：558～561附：原始数