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《银屑病mRNA原位杂交技术的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、2008年2月陕西教育学院学报Feb.2008第24卷第1期JournalofShaanxiInstituteofEducationVol.24No.1银屑病mRNA原位杂交技术的研究12王汉屏,杨章民(1.陕西教育学院生命科学系,陕西西安710061;2.陕西师范大学生命科学学院,陕西西安710062)摘要:通过对38例银屑病(Psoriasis)皮肤组织中HB-EGF的表达,比较了核酸原位杂交过程中包括组织固定、脱水、浸蜡、包埋及切片过程中,外源性RNase控制与原位杂交
2、结果之间的关系。结果表明,外源性RNase控制组的阳性信号高于非控制组,其原位杂交结果反映了基因表达的水平。提示在石蜡切片核酸原位杂交实验中,切片制备及保存过程中防止外源性RNA酶污染,是提高结果可信度的关键。关键词:银屑病;原位杂交;RNase控制;石蜡切片;基因表达+中图分类号:R758.63;Q522.2文献标识码:A文章编号:1008-598X(2008)01-0090-03原位杂交也称杂交组织化学技术(Hybridizationhistochemistry)、细胞杂交(Cyto
3、logicalhybridization)或原位杂交组织化学技术(Insituhybridizationhistochemistry),是将分子杂交与组织化学技术相结合的一项分子生物学技术,也是分子生物学5大技术之一,广泛地应用于科研及临床检验中,是从分子水平反映基因存[1]在或表达的一种常用手段。以地高辛(Digoxigenin,Dig)标记寡核苷酸探针检测石蜡切片组织内mRNA的方法已广泛应用于包括肿瘤标本、皮肤病标本中目的基因的检测。虽然寡核苷酸探针具有探针易于制备、探针与mRNA形成的D
4、NA-RNA杂交体稳定,不易受RNA酶的降解等优点,但组织内待检测的mRNA易被外源性RNase降解。故在杂交体形成之前如何防止外源性RNase对石蜡切片组织中mRNA的破坏成为核酸原位杂交成败的关键。为此本文对核酸原位杂交过程中不同环节的外源性RNase控制与杂交结果之间的关系进行了探讨,以期阐明二者的关系。1材料和方法1.1材料银屑病标本,38例,取自西安交通大学第二医院皮肤科。载玻片的处理:(1)市售载玻片经洗洁精浸泡,流水冲洗;(2)高锰酸钾洗液浸泡12h,流水冲洗干净;(3)洗洁液
5、煮沸30min,蒸馏水冲洗,自然风干;(4)180烤片5h;(5)多聚赖氨酸或APES包被,备用。1.2试剂焦碳酸二乙酯(DEPC)购自SIGMA公司,取原液1ml加入1000ml双蒸水中,37保温过夜,高压灭菌后使用;0.01MPBS及10!SSC均用未高压灭菌的0.1%DEPC水配制,高压灭菌后使用;肝素结合表皮生长因子样生长因子(Heparinbindingepidermalgrowthfactor-likegrowthfactor,HB-EGF)原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程
6、有限公司;4%多聚甲醛(PFA):称取40gPFA溶于500ml的0.1%DEPC水中,60-65持续加热磁力搅拌,使之成为乳白色悬液,用1.0mol/L的NaOH调pH值至7.0,使之呈清[2]亮状,再加入500ml的2!PBS,充分混匀,调pH值,定容至1000ml,室温保存备用。1.3切片的制备及保存取材后立即用生理盐水清洗,将每例标本分成2份。其中一份作受试组,即在组织的固定、脱水、浸蜡、收稿日期:2008-01-03基金项目:陕西教育学院科研基金项目(06KJ013)作者简介:王汉
7、屏(1954-),男,陕西安康人,陕西教育学院生命科学系副教授。90包埋及切片过程中严格控制外源性RNA酶的污染,依次经历多聚甲醛固定(室温12h)、常规步骤梯度酒精(用0.1%DEPC水配制)脱水、浸蜡、包埋。切片时先用0.1%DEPC水擦洗切片机刀面,展片(用0.1%DEPC水),切片厚度5m,贴于预处理的载玻片上;对照组不进行RNase保护处理,仅按常规病理切片进行脱水、浸蜡、包埋和切片。随后烘干(24h),-70保存备用。1.4原位杂交-70取出切片,置37烘干,脱蜡,梯度酒精水化
8、,0.01MPBS液洗5min2次;3%H2O2室温10min封闭内源性过氧化物酶;0.01MPBS液洗5min3次;25g/ml胃蛋白酶消化3720min;0.01MPBS液洗5min3次;滴加预杂交液42预杂交2h,加入20lHB-EGF探针,42杂交20h;杂交后检测按原位杂交试剂盒说明书进行,DAB显色、苏水素复染、常规脱水、透明、封片。以不加探针的预杂交液替代探针作阴性对照。2结果对38例标本进行的原位杂交检测,可在细胞浆内检测到棕褐色阳性信号。光镜下阳性细胞计数发现,外源RNa
