mRNA原位杂交步骤.pdf

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1、原位杂交检测石蜡包埋组织mRNA注意事项:1.杂交前和杂交过程中所用物品设备应防止RNase污染2.相关试剂均需用DEPC处理过的双蒸水配制(双蒸水中加入0.1%DEPC,摇动放置3-4小时,高压消毒灭活DEPC后备用)3.试剂配制应防止RNase污染相关试剂配置1.DEPC-PBS(DEPC处理的磷酸盐缓冲液):140mMNaCL;2.7mMKCL;10mMNa2HPO4;1.8mMKH2PO4pH7.4(用DEPC处理的双蒸水配置)2.TE缓冲液:10mMTris,1mMEDTA,pH8.03.0.1M三

2、乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺5.33mlDEPC处理的双蒸水定容至1L4.20SSC175.3g;柠檬酸三钠88.2gDEPC处理的双蒸水定容1L5.100Denhardt’s:Ficoll4002g;PVP(聚乙烯吡咯烷酮)2g;BSA(小牛血清白蛋白)2g;DEPC处理的双蒸水定容至100ml6.寡核甘酸探针杂交缓冲液:配制20ml(20SSC4ml;硫酸葡聚糖4g;去离子甲酰胺10ml;PolyA(10mg/ml)0.5ml;鱼精ssDNA(10mg/ml)0.5ml;tRNA(10mg/ml)0.5

3、ml;1M二硫代苏糖醇(DTT)2ml;50Denhardt’s0.2ml(-20保存使用前平衡到377.缓冲液A:100mMTris-HCL(pH7.5);150mMNaCL8.封闭液:缓冲液A中加入0.1%Triton-X100和2%正常山羊血清9.缓冲液B:100mMTris-HCL(pH9.5);100mMNaCL;50mMMgCL210.缓冲液C:10mMTris-HCL(pH8.1);1mMEDTA程序1.二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,DEPC处理的ddH2O速洗两次,DEPC-PBS(用DEPC处理

4、过的双蒸水配制的磷酸盐缓冲液)洗25分钟2.DEPC-PBS稀释的0.3%Triton-X100处理15分钟3.DEPC-PBS洗25分钟4.TE缓冲液稀释的Rnase-free蛋白酶K(蛋白酶K用于石蜡切片的建议浓度为5-20g/ml)在37孵育10-30分钟或者0.2MHCL稀释的0.1%胃蛋白酶(胃蛋白酶用于石蜡切片的建议浓度为100-500g/ml)在37孵育20-30分钟(具体孵育时间需自行摸索)5.如果用蛋白酶处理,处理后PBS+2mg/ml甘氨酸洗30秒至1分钟,然后DEPC-PBS洗25分钟;

5、如果用胃蛋百酶处理,处理后DEPC-PBS洗25分钟6.DEPC-PBS稀释的4%多聚甲醛后固定10-15分钟7.DEPC-PBS洗25分钟8.0.1M三乙醇胺稀释的0.25%醋酸酐孵育10分钟(0.1M三乙醇胺稀释的0.25%醋酸酐需在孵育前配置并立即使用且不能二次使用)9.2SSC洗3分钟10.不含探针的寡核甘酸探针杂交缓冲液在37孵育2小时11.2SSC洗5分钟12.含探针杂交缓冲液在37孵育约18小时13.1SSC在室温下速洗,1SSC在55水浴摇洗215分钟,0.5SSC在55水浴摇洗215分钟,0

6、.5SSC在室温下洗10分钟14.缓冲液A摇洗210分钟15.室温下封闭液孵育30分钟16.除去封闭液在室温下用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体孵育2-4小时(抗体用封闭液稀释)17.缓冲液A洗210分钟18.缓冲液B室温孵育10分钟19.BCIP/NBT避光显色2-24小时(由于石蜡组织在固定处理制作过程中难免有RNA的降解,我们建议用碱性磷酸酶-BCIP/NBT显色系统,因为其敏感性较辣根过氧化物酶-DAB显色系统更高)20.缓冲液C终止显色,然后浸入蒸馏水21.核固红套染(可染或不染),水溶性封片剂(wat

7、er-solublemountingmedia)封片,显微镜观察结果.