《质粒提取方法》PPT课件

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1、质粒三种提取方法的比较基因工程原理与技术实验部分：质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(OpencircularDNA,简称ocDN

2、A)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(LinearDNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。实验目的：1、学会小量制备质粒DNA的碱裂解方法、煮沸法、小量一步提取法这三种质粒DNA的提取方法。2、三种方法的比较，能够根据不同的实验目的选择合适的方法。实验原理：碱变性原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密

3、结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；DNA双链变性DNA单链复性强碱中性染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性煮沸法：将细菌悬浮于含TritonX-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性

4、。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力后复性。但质粒DNA的复性要快于细菌染色体DNA。小量一步提取法：从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:1、培养细菌使质粒扩增2、收集和裂解细胞3、分离和纯化质粒DNA材料、设备及试剂一、材料含卡那酶素的E.

5、coliDH5α，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。二、设备微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。三、试剂1、LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。3、氨苄青霉素

6、(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备用。4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。5、3mol/lNaAc(pH5.2)：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100ml,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。6、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分

7、钟,储存于4℃冰箱。7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(临用前用5-10mol/LNaOH母液稀释)，1％SDS。8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。10、饱