《质粒DNA的提取》PPT课件

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1、质粒DNA的提取小组成员：卜斌、王桂平、陈茜柳文祥、王宣高基本原理：1.掌握碱裂解法提取质粒的原理2.了解实验中所使用的试剂的作用技术操作:1.碱裂解法抽提大肠杆菌质粒DNA什么是质粒（plasmid）？?质粒是染色体外的稳定遗传因子?大小1-200Kb?双链、闭环、超螺旋DNA?主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中?自主复制和转录，并表达所携带的遗传信息。碱裂解法抽提质粒DNA基本原理：利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异实现质粒的分离。染色体DNA与质粒DNA双螺旋结构解开氢键断裂，保持双螺旋沉淀物可溶状态大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质上清中的质粒质

2、粒DNA酚氯仿抽提NaOH和SDS溶液裂解变性加入中和液迅速复性在高盐浓度下，染色体DNA交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L）；Tris·HCl（25mmol/L，pH8.0）低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。EDTA的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。溶液Ⅱ：NaOH（0.2mol/L）；SDS（1%，新鲜配制）溶液II：SDS的作用：破

3、坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH(pH>12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。溶液Ⅲ：60ml的5mol/LKAC；11.5ml的冰醋酸；28.5ml水溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使DNA复性。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。