基因工程的酶学基础(II)

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1、第二章基因工程的酶学基础Enzymes工具酶种类:RestrictionendonucleaseDNAligaseDNApolymeraseDNAprosessingenzyme一、限制性核酸内切酶第一节限制性核酸内切酶一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并在相关位置切割DNA双链的核酸内切酶。（Restrictionendonuclease）I型限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶M.Meselson和R.Yuan在19

2、68年从大肠杆菌B株和K株分离的。（1）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性内切酶如EcoB和EcoK。未甲基化修饰的特异序列。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理距离特异性识别位点约400-7000bp，切割序列没有专一性。Recognizesitecut400-7000bp（2）切割位点2.III类限制性内切酶识别位点严格专一（不是回文结构），但切点不专一，往往不在识别位点内部。反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）,数量较少。在

3、基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG24-26bp未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列--palindrome）。3.II类限制性内切酶形成stickyend或bluntend识别位点严格专一，识别位点或两侧处切割。EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端（1）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①5’

4、端凸出（如EcoRI切点）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG②3’端凸出（如PstI切点）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTC连接便利（2）粘性末端的意义不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。异源同工酶:来源不同，但具有相同的识别序列的限制性内切酶。（3）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：识别序列和切点

5、完全相同。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。酶切后产生不同的DNA末端。②不完全同裂酶：来源不同，识别序列不同，但是切割DNA分子所得的DNA片段具有相同的粘性末端。（4）同尾酶(Isocaudamer）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA

6、-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。5’-GATC----3’3’----CTAG-5’Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般(不能or能？)再被原来的酶识别。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3Ahybridsite杂交位点（hybridsite）：同尾酶切割DN

7、A产生的末端连接后所形成的新的位点。焊死：同尾酶产生的粘性末端连接后，不能用任何一种酶酶切。（5）识别位点在DNA分子中的频率假定核苷酸随机排列，四碱基酶大约256个核苷酸有一个识别序列，而六碱基的酶大约有4096个核苷酸有一个识别序列。λDNA长49kb，对于六碱基的酶应该有（）个切割位点？理论上有n个核苷酸的识别序列的酶出现概率为（）。121/4n（6）II型限制性内切酶酶解反应的条件大部分需要相似的反应条件Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mM0-50mM低盐酶NaCl0-150mM50-100mM中盐

8、酶DTT（二硫苏糖醇）1mM100-150mM高盐酶Volume20-100ulT37℃>1hr一部分为50-65℃，少数25-30℃DNA中的杂质如蛋白质、酚、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度三、影响限制性内切酶活性的因素①纯化DNA②加大酶的用量1ugDNA用10U酶③延长