基因工程的酶学基础.ppt

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1、第二章基因工程的酶学基础Enzymes第一节　限制性内切核酸酶—“分子手术刀”第二节DNA连接酶——“分子缝合针”第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节　外切核酸酶第六节　单链内切核酸酶第七节　ＲＮＡ酶核酸酶(nucleases):是指通过切割相邻两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，使核酸分子发生水解断裂的酶。按底物不同分为：DNA酶（DNase）RNA酶（RNase）底物非专一性核酸酶按作用部位不同分为：5´末端外切酶核酸外切酶3´末端外切酶核酸内切酶一、限制－修饰系统第一节限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种

2、特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。.切点：磷酸二酯键2.性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保护作用3.功能1.来源早在上世纪60年代Linn和Arber在研究噬菌体的寄主范围时发现如下的现象：分别在E.coli的K菌株和B菌株上生长的λ噬菌体（称λK和λB）能高效感染各自的宿主;但用λK感染B菌株或用λB去感染K菌株则感染率会大大降低，这就是限制。如果一旦λK感染B菌株成功则在B菌株中形成的后代也就能高效感染B菌株，再也没有限制现象，这个现象称为修饰。限制和修饰是由宿主控制的，

3、故称为宿主控制的限制和修饰作用。限制-修饰系统（restriction-modificationsystem）研究发现，细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，一起构成限制-修饰系统。十年后，搞清了细菌的限制与修饰分子机理：由三个基因位点所控制：hsdR,hsdM,hsdShsdR---限制性内切酶hsdM---限制性甲基化酶hsdS---控制两个系统的表达1限制性核酸内切酶限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。1限制性核酸内切酶例：M.EcoRI催化

4、s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoRI的切割修饰：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。现已从各种微生物中发现与鉴定出3800余种限制-修饰系统，其中有限制性内切核酸酶3819个、甲基转移酶844个。现已商品化的限制酶624个，甲基转移酶32个。二、限制性内切核酸酶的类型Ⅰ型限制性内切酶（90个）目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。Ⅱ型限制性内切酶（3714个）Ⅲ型限制性内切酶（12个）Ⅳ型限制性内切酶（3个）1.I型限制性内切酶1968年首先由

5、M.Meselson和R.Yuan在从大肠杆菌B株和K株分离的如EcoB和EcoK（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1限制性核酸内切酶（2）切割位点在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链（3）作用条件需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）1限制性核酸内切酶首先由美约翰·霍布金斯大学的H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来分离的第一个酶是HindⅡ（识GTCGAC）（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（

6、多数是回文序列）,与DNA的来源无关2.II类限制性内切酶1限制性核酸内切酶（2）切割位点识别位点处切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）如：EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端1限制性核酸内切酶（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链的末端分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）1限制性核酸内切

7、酶②3’端凸出（如PstI切点）3.III类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA（一般在识别位点24-26bp），但反应需要ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸）。EcoP1:AGACC——EcoP15:CAGCAG——在基因工程操作中用途不大1限制性核酸内切酶I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性双功能的酶内切酶和甲基化酶分开双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一亚基2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6

8、GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG