基因工程的酶学基础(I)

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1、2基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶第四节DNA修饰酶第五节核酸外切酶第六节单链核酸内切酶1一、限制性核酸内切酶第一节限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（Restrictionendonuclease）22.性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保护作用3.功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源34细菌自身DNA的碱基被

2、甲基化酶甲基化(修饰)，不能被自身的限制性内切酶识别切割而保护。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。（1）限制（Restriction5（3）限制与修饰系统相关的三个基因①hsdR:编码限制性内切酶②hsdM:编码限制性甲基化酶③hsd

3、S:编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰DNA的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。61973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：二、限制性内切酶的命名用属名的第一个字母大写种名的前两个字母小写由3个字母形成的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluen

4、zae）用Hin表示74.如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如Hind：d菌株EcoR：抗药性R质粒85.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。如HindⅡ：d菌株中发现的第二个酶6.所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如R.HindⅢ表示限制性内切酶M.HindⅢ表示相应的甲基

5、化酶实际应用中，R常被省略。9属名种名株名HindIIIHindIIIHaemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名10目前已发现600多种限制性内切酶，分为三类。三、限制性内切酶的类型限制性核酸内切酶的分类分类依据1）依据识别序列与切割位点是否一致2）所需辅助因子分为三类：I型酶、II型酶、III型酶11首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。（1）识别序列Eco

6、B：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.Ⅰ型限制性内切酶的基本特性如EcoBEcoK未甲基化修饰的特异序列12需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）辅助因子在距离特异性识别序列上游约1000—1500bp处随机切开一条单链，两条链上的切点相距70~75bp，即末端为单链。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位点13I型酶：限制修饰系统酶异源多聚体，R、M、S分别为限制性内切酶、甲基化酶、特异位点识别的活性。识别序列全甲基化-不识别识别序列半甲

7、基化-甲基化作用识别序列未甲基化-限制性内切酶作用识别序列与切割位点不一致，且切割位点随机不定ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）142.Ⅲ型限制性内切酶识别序列与切割位点不相一致切割位点相对固定反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG15识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割（一致）序列呈典型的旋转对称型回文结构2.Ⅱ类限制性内切酶的基本特性5‘…GCT

8、GAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点16EcoRI等产生的5’-粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃退火4-7℃5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-