基因工程的酶学基础ppt课件.ppt

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1、第六章基因工程的酶学基础1限制性内切酶DNA连接酶DNA聚合酶和反转录酶DNA修饰酶外切核酸酶单链内切核酸酶RNA酶2核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而使核酸分子断链。根据水解的不同方式，分为：外切核酸酶（exonuclease）内切核酸酶（endonuclease）根据作用的核酸底物不同，分为：RNA酶DNA酶底物非专一性核酸酶36.1限制性内切酶定义：限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。41.细菌限制修饰系统

2、的发现20世纪60年代在研究噬菌体的寄主范围时发现的。从天然宿主大肠杆菌K中分离得到的λk噬菌体，当其感染B菌株时，感染率仅为10-4，分离得到幸存的子代λk病毒，再用其感染B菌株，感染率为100%；若再用其感染K菌株，感染率又降为10-4。此现象称为宿主限制现象。一、限制性内切酶的发现5各种细菌都能合成一种或几种能够切割双链DNA的内切核酸酶，以此来限制外源DNA在自身细胞内的存在。几乎所有的限制性内切酶都和能识别甲基化相同DNA位点的甲基转移酶共同作用，构成限制-修饰系统。宿主细胞的DNA被甲基转移酶修饰而被保护起来，不被限制性内切酶

3、识别，从而使自身DNA免受降解。62.限制酶HindIII的发现Smith等于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到HindIII限制酶。3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制Nathans（1971年）用HindIII绘制SV40的限制酶谱。7二、限制性内切核酸酶的类型已经鉴定出的限制性内切核酸酶可分为4种不同类型：Ⅰ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别位点附近的核苷酸切割DNA双链，但切割序列是随即的，无专一性。在基因工程中应用不大。Ⅱ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别序列的固定位置切割双链DNA分

4、子，是基因工程中最常用的工具酶。8Ⅲ型酶：有专一的识别序列，但不是对称的回文序列，在识别序列旁边的位置上切割双链。切割后产生的DNA片段具有各种单链末端。Ⅳ型酶：新鉴定出的一种酶，目前无应用。9命名原则：属——种——株——分离序号例如：EcoRⅠ属：Escherichia种：coli株：R分离序号：Ⅰ三、限制性内切酶的命名10第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属种株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的

5、第三种酶11（一）识别序列的特异性大多数Ⅱ型限制内切酶的识别序列长度为4~6bp，具有双重旋转对称结构的回文序列（palindromicsequence）。四、Ⅱ型限制内切酶的基本特性GGATCCCCTAGGBamHⅠ：如果识别序列由5对碱基组成，其对称轴为中间的一对碱基，如MaeⅢ的识别序列为：--GTNAC----CANTC--其中，N为任意碱基。12回文诗悠悠绿水傍林偎，日落观山四望回。幽林古寺孤明月，冷井寒泉碧映台。鸥飞满浦渔舟泛，鹤伴闲亭仙客来。游径踏花烟上走，流溪远棹一篷开。开篷一棹远溪流，走上烟花踏径游。来客仙亭闲伴鹤，泛舟

6、渔浦满飞鸥。台映碧泉寒井冷，月明孤寺古林幽。回望四山观落日，偎林傍水绿悠悠。1314有些限制性内切酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，但不影响其作用位点，只是增加酶的识别和作用频率。如HindⅡ识别序列为--GTYRAC--，其中Y表示C或T，R表示A或G。有的酶识别6个以上的核苷酸序列，称为稀有限制性内切酶，如NotⅠ，识别序列为（GCGGCCGC）15（二）切割位点的特异性1.DNA分子酶切片段的末端切割：水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为磷酸基，3’端为羟基。16酶切后产生的片段末端有黏性末端和平末端等

7、形式。黏性末端：DNA分子在限制性内切酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构。它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。17（1）在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。靠近5’端切割产生5'端突出的粘性末端，如EcoRI：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'5’5’18（2）靠近3'端切割产生3'端突出的粘性末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…GACGTC…5'3’3’195'…C

8、CC▼GGG…3'SmaI5'…CCCGGG…3'3'…GGG▲CCC…5'3'…GGGCCC…5'（3）在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（bluntend），如SmaI：20