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《《动物寄生虫病学》许金俊-实验十二动物寄生虫病的分子生物学诊断》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、实验十二动物寄生虫病的分子生物学诊断一、实验目的和要求本实验以弓形体病的PCR诊断为例介绍动物寄生虫病的分子生物学诊断方法，让学生了解动物寄生虫病的分子生物学PCR诊断方法的如本原理和操作步骤。二、实验材料和仪器设备1、弓形虫虫株：NT株(猪源汤山分离株)购自江苏省农科院，本实验室保存。2、实验动物:ICR小鼠(18—22g),购自扬州大学比较医学中心。3、NT株弓形1UDNA：人工感染MT株ICR小鼠腹水，按照酚一氯仿法提取DNA,分光光度计进行定最，分装后保存于-20°Co4、试剂：蛋白酶K(上海Promega公司)，dNTPs,M
2、gcl2,TaqDNA聚合酶，DL2000Marker购自上海生物工程公司。GenomeDNAExtractionKit(codeD9081)购自TaKaRa公司(大连)。英他常规试剂均为国产分析纯级，购ft扬州市屮林生化试剂有限公司。5、引物：据Burg等(1989)提供的B1基因设计并合成1对引物：上游引物P1：5'-GGAACTGCATCCGTTCATGAG一3'(694-714bp)和下游引物P2：5，-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3(887-868bp)o该引物扩増片断长度为194bpo据J.T.Ellis等(1
3、998)的报告设计并合成第2对引物，上游引物P3为5，-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3'；下游引物为P45'-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3',PCR产物的长度529bp„以上2对引物由大连宝生物公司合成。6、仪器：PCR扩增仪,新加坡生产的PCRsystem2400型和徳国生产的T-GradientThermoblock；电泳仪，北京市六一仪器厂生产的DYY-2型稳压稳流电泳仪；凝胶数码成像系统，上海天能科技有限公司生产的Gis-2008型；冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂，TGL—1
4、6G—A型。6、耗材：PCR管、琼脂糖、Tip头、冰盒等7、试剂的配制(1)PBS缓冲液(pH7.4):在800mL水中加入NaCL18g,KCL0.2g,NaHP0(1.44g,KH2PO40.24g,以HC1调至pH7.4,加水定容至1000mL。(2)DNA提取液：10mmol/LTris-HClpH8.0,0.lmol/LEDTApH8.0,0.5%SDS(3)TE缓冲液(Tris-EDTA缓冲液)(pH8.0)：10mmol/LTris-HClpH8.0,lmol/LEDTA(4)50mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)
5、:称取9.30625gEDTA,加入40mL双蒸水，加入NaOH(约1.3g)使JtpH8.0,然后加入双蒸水，使艮为50mL。(5)0.1mol/LTris-HCl(pH&O)的配制：称取Tris1.214g,加入双蒸水，用浓HC1调整其pH&0。(6)无DNA酶的RNA酶的配制:将胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100°C加热15min,缓慢冷却至室温，分装，保存于一20°C。(7)10%SDS的配制：在900mL水中溶解100g电泳
6、级SDS,加热至68°C助溶,加入几滴浓HC1调节溶液的pH值至7.2,加水定容至1000mL,分装备用。(8)ACD抗凝液：柠檬酸0.84g,柠檬酸钠1.32g,葡简糖1.47g,加水至100mL.(9)TAB缓冲液:10mmol/LTris-HClpH7.5,10mmol/LKC1,2mmol/LEDTA,4mmol/LMgCl2(10)加样缓冲液：0.25%浪酚蓝，0.25%二甲苯青，15%聚蔗糖，配制后室温保存。(11)饱和酚一氯仿一异戊醇(25：24：1)：饱和酚25份加氯仿24份加1份异戊醇。（12）氯仿一异戊醇（24：1）
7、：氯仿24份加1份异戊醇。三、实验方法和步骤1、猪组织样品的采集：活畜或屠宰动物的组织样品如肺和肺门淋巴结、腹水或者抗凝全血,无菌采集待检样品，4C保存待检。2、组织内弓形虫模板DNA的制备：取肺及肺门淋巴结组织各lg,去掉筋膜，剪碎，加入lml裂解液，以匀浆器研磨成细胞匀浆，加入蛋白酶K使其终浓度为1OOPg/ml,55水浴2h,不时摇振。取出水浴中的指形管，加等体枳饱和酚一氯仿一异戊醇，上下缓慢颠倒10次，室温下，12000rpin离心5min。吸取上层水相，置丁•另一指形管中，加入等体枳氯仿一异戊醇，轻轻混匀，12000mm离心5
8、mino吸取上层液相，置于另一指形管中，加入等体枳氯仿，轻轻混匀，12000“ni离心5mino吸取匕层液相，置于另一指形管中，加入2倍体积的无水乙醇,置于一20°C15min以上,沉淀DNA。取出指形管,
