查尔酮抗金黄色葡萄球菌分选酶A和α-溶血素的作用研究

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1、分类号：Ｓ８５９．７单位代码：１０１８３研究生学号：２０１５８５２０１２密级：公开吉林大学硕士学位论文学术学位（）查尔酮抗金黄色葡萄球菌分选酶Ａ和α－溶血素的作用研究ＣｈａｌｃｏｎｅＡｔｔｅｎｕａｔｅｓＳｔａｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＶｉｒｕｅｎｃｅｂｐｌｙＴａ－ｒｇｅｔｉｎｇＳｏｒｔａｓｅＡａｎｄＡｌｈａＨｅｍｏｌｓｉｎｐｙ作者姓名：张冰专业：基础兽医学研究方向：兽医药理毒理指导教师：邓旭明教授培养单位：动物医学学院２０１８年６月未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单

2、位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士或硕士学位论文原创性声明（）：本人郑重声明所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容夕卜，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。■Ｓ学位论文作者签名：＊日期：別８年６月３曰查尔酮抗

3、金黄色葡萄球菌分选酶A和α-溶血素的作用研究ChalconeAttenuatesStaphylococcusaureusVirulencebyTargetingSortaseAandAlpha-Hemolysin作者姓名：张冰专业名称：基础兽医学指导教师：邓旭明教授学位类别：农学硕士答辩日期：2018年06月03日中文摘要查尔酮抗金黄色葡萄球菌分选酶A和α-溶血素的作用研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，金葡菌）是一种临床上常见的革兰氏染色阳性的机会致病菌，可以引起多种疾病，如菌血症、感染性心内膜炎、关节炎以及皮肤和软组织感染。近年来，金葡菌耐药性对于细菌性感

4、染的治疗造成了极大的困难，传统的抗菌策略往往是直接抑制或者杀灭细菌，这一方式固然高效但是会对细菌产生很大的生存压力，加速了细菌耐药性的产生，从而产生恶性循环，因此临床上迫切需要新的抗感染策略和药物。随着对细菌致病力分子机制研究的逐步深入，抗毒力策略的提出无疑为解决上述问题提供了新的思路。分选酶A（SortaseA，SrtA）是一种转肽酶，可以特异性地识别多肽序列LPXTG（Leu-Pro-X-Thr-Gly），从而将细菌的多种表面蛋白锚定在细胞壁上，而这些表面蛋白在细菌入侵靶细胞的过程中，发挥着重要的作用。α-溶血素（α-hemolysin，Hla），由hla基因编码，是一种水溶性成孔

5、毒素，可以在多种宿主细胞细胞膜表面形成七聚体，从而使细胞发生损伤或死亡。近些年来，SrtA和Hla被视为新的药物靶点，所以许多针对它们的研究也渐渐成为了热点。本研究以耐药性金葡菌SrtA和Hla为靶标，建立了多重抑制剂筛选平台，筛选出了潜在的毒力因子抑制剂，并阐述了其抑制金葡菌SrtA和Hla的作用机制，从而为解决细菌性感染这一重大议题提供新的解决思路。在本研究中，我们通过荧光共振能量转移试验、溶血试验、侵袭试验、粘附试验等，发现小分子天然化合物查尔酮，在较低的浓度下（IC50为53.15μM）可以显著抑制金葡菌SrtA的活性，从而减少金葡菌表面蛋白A的锚定、金葡菌与纤连蛋白的结合、生

6、物膜的形成并阻止细菌的侵袭，而此浓度并不影响细菌的生长。同时发现，低浓度的查尔酮（IC50为17.63μM）可以显著降低金葡菌溶血素的溶血活性。荧光定量PCR试验结果表明，查尔酮通过抑制Hla编码基因hla及其上游的正向调控系统Agr二元调控系统的转录使得Hla的表达量下降从而降低了金葡菌I的溶血活性。体外组织感染试验和体内小鼠感染模型试验研究表明，查尔酮对金葡菌溶血素所介导的A549细胞的细胞损伤有很好的保护效果，同时可以降低肺炎模型小鼠的死亡率。分子动力学模拟和定点残基突变试验表明查尔酮通过与金葡菌SrtA的结合，从而抑制了SrtA的活性，其结合的主要残基为Val168，Ile18

7、2和Arg197。综上，本研究表明查尔酮是一种潜在的抗金葡菌感染的先导化合物，同时也为致病性耐药菌的感染治疗提供了新的理论基础。关键字：金黄色葡萄球菌，SortaseA，α-溶血素，查尔酮IIAbstractChalconeAttenuatesStaphylococcusaureusVirulencebyTargetingSortaseAandAlpha-HemolysinStaphylococcusaureus(S.aureus),aclin