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《抗藤黄微球菌Rpf结构域单克隆抗体制备及特性鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、抗藤黄微球菌Rpf结构域单克隆抗体制备及特性鉴定【摘要】目的：克隆、表达藤黄微球菌Rpf结构域多肽,并制备针对该多肽的单克隆抗体(mAb)o方法：采用聚合酶链反应(PCR)藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf结构域基因，用限制性内切酶消化后插入到pUC19克隆载体中，测序正确后，再亚克隆到融合表达载体pProEXHT中，转化大肠杆菌DH5a,目的基因经IPTG诱导，由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf结构域基因多肽，在变性条件下纯化目的蛋白。用纯化的目的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，进行细胞融合、克隆化制备抗Rpfdomain单抗(mAb),用ELISA法初步鉴定
2、其特异性和相对亲和力。结果：在变性条件下用Ni2+NTA亲和色谱柱纯化目的融合蛋白，纯化获得的蛋白纯度大于90%0用该融合蛋白免疫小鼠后，获得了3株抗RpfdomainmAb,这3株mAb均特异性识别Rpfdomain多肽。结论：所获得的抗RpfdomainmAb特异性强、效价高，对进一步研究Rpfdomain在结核病免疫预防中的作用提供了有力的工具。【关键词】结核分枝杆菌藤黄微球菌RpfdomainmAb结核病是现今全世界范围内最重要的致病和致死因素之一。目前，全世界约有1/3的人感染，每年约800万的新发病例和300万的患者死亡，我国就有500万肺结核患者,位居世界第二。处于结核分支杆菌感
3、染状态而未发病的人群（主要是成年人）中只有10%有可能最终发展成为活动性结核病患者，而绝大多数以潜伏感染的形式存在，此时结核杆菌处于休眠状态，当机体免疫力低下时，休眠的结核菌激活引发结核病。m2Mukamolova等口，2］发现在藤黄色微球菌（Micrococcusluteus）种发现了一种能促进细菌复苏生长的因子，被命名为复活促进因子（resuscitationpromotingfactor,RpfBiketov等［3］则发现Rpf可促进巨噬细胞内受损的休眠期的结核杆菌进入活化增殖状态。通过同源性分析发现，结核分枝杆菌（MTB）基因组可编码5种Rpf样蛋白,Rpf样蛋白存在于多种富含G+C
4、的革兰氏阳性细菌中，基因所编码的蛋白均具有Rpf样作用域，单独的Rpf作用域具有与Rpf样蛋白一致的生物学功能［4］。本研究中，我们克隆表m2达并纯化藤黄微球菌Rpf结构域多肽，将表达的蛋白纯化后作为免疫原，制备了高特异性、高效价的mAb,并进行了特异性鉴定。1材料和方法1.1材料藤黄微球菌标准株、E.coliDH5a为西京医院检验科细菌室保存;TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4连接酶、HindIII.BamHI及DNA电泳胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒、PEG、HT及HAT购自Promega公司;pProEXHT质粒为第四军医大学动物实验中心师长宏博士馈赠；Sp2/0细胞系由第四军医大学
5、微生物教研室馈赠;BALB/c小鼠（雌性，6~8周龄）由第四军医大学动物实验中心提供；6HismAb购自第四军医大学免疫学教研室;HRP山羊抗小鼠IgG抗体购自华美生物公司；Ni2+NTA纯化试剂盒购自Invitrogen公司；胎牛血清购自杭州四季清公司；其余试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1引物的设计登陆GenBank,根据藤黄微球菌Rpf结构域基因序列设计引物。P1:5rAGTGGATCCGCCACCGTGGACACCTG3Z含BamHlM切位点；P2:5’CTGAAGCTTTTACAGCTTCTGCGAGCACAG3’含Hindlll酶切位点和终止码。扩增片段为253bp,由TaK
6、aRa公司合成。1.2.2藤黄微球菌基因组DNA的提取^=1刮取适量藤黄微球菌落，TE(pH8.0)洗涤后重悬，加SDS至终浓度为10g/L,蛋白酶K至终浓度0.1g/L,55〜609水浴过夜，分别用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次，上层水相加2.5倍预冷的无水乙醸1/10体积3mol/L乙酸钠后置-209冰浴1h沉淀DNA,用无水乙醇、700mL/L乙醇先后洗涤沉淀2次，抽干后溶于适量无菌水中1.2.3藤黄微球菌Rpf结构域基因的扩增、克隆及测以藤黄微球菌基因组为模板，以P1和P2为引物，扩FT增目的基因。PCR反应条件：94°C60s,57°C6
7、0s,72°C90s,共30个循环，再于72°C延伸7mino回收PCR产物，经BamHI和Hindlll消化后，然后用T4连接酶连接入经同样酶消化的pUC19中，转化E.coliDH5a感受态细胞。然后涂布于IB平板(含氨节青霉素100mg/L),随机筛选4落，分别接种于5mL含氨节青霉素的IB培养液中，379振荡培养过夜，提取质粒DNA,用Hindlll和BamHI双酶切,增目的基因。PCR反
