藤黄微球菌rpf结构域多肽诱导小鼠免疫应答的实验研究

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1、藤黄微球菌Rpf结构域多肽诱导小鼠免疫应答的实验研究【摘要】目的:研究藤黄微球菌Rpf结构域多肽的免疫学特性。方法:用原核表达的藤黄微球菌Rpf结构域多肽免疫BALB/c小鼠3次,每次间隔2周。用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度。分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增值指数。ELISA方法检测淋巴淋巴细胞悬液中IFNγ、IL10和IL12产生水平。另一部分免疫的小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后,计数脾脏细菌负荷数。结果:藤黄微球菌Rpf结构域

2、多肽免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶128000,淋巴细胞增殖指数为(2.10±0.12),明显高于生理盐水对照组(0.90±0.21)。ELISA方法检测Rpf结构域多肽免疫组IFNγ,IL10和IL12水平为(1126±36)ng/L,(368±13)ng/L和(289±14)ng/L,明显高于生理盐水对照组(P<0.01)。与生理盐水免疫组(细菌负荷6.64±0.13)相比较,Rpf结构域多肽免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有明显作用(细菌负荷为5.03±0.11,P<0

3、.05)。结论:藤黄微球菌Rpf结构域多肽有可能作为新型结核疫苗的候选组分。【关键词】藤黄微球菌免疫学特性Rpf结构域　　卡介苗（BCG）是目前惟一用于结核病（tuberculosis,TB）预防的疫苗,但其存在保护期短,免疫应答较弱以及对隐性感染者无效等问题[1]。因此研究新的疫苗用于TB的预防已成为当前国内外研究热点。为此,我们在前期工作的基础上,以原核表达的藤黄微球菌Rpf结构域多肽[3]免疫小鼠后,检测其诱导的体液免疫、细胞免疫及其在动物体内的保护力,以期为结核新型疫苗的研制提供实验依据。　　1材料和方法　　1

4、.1材料7H9液体培养基购自Difco公司。属源性IFNγ、IL10和IL12的ELISA检测试剂盒购自晶美公司。MTBH37Rv由陕西省结核病防治研究所惠赠。BCG疫苗株由兰州生物制品研究所出品（国药准字SF20010035,批号20011201）。RPMI1640及MTT购自Sigma公司。羊抗属IgGHRP购自华美生物公司。Ni2+NTA纯化试剂盒购自Invitrogen公司。PROEXHTRpfdomain为编码藤黄微球菌Rpfdomain蛋白基因的原核表达质粒为本实验室构建[2]。6～8周龄BA

5、LB/c雄性小鼠由第四军医大学实验动物中心提供。　　1.2方法　　1.2.1Rpfdomain的表达及大量纯化将pPROEXHTRpfdomain质粒转化的E.coliDH5α,接种10mLLB培养液中,37℃振荡培养2～3h,0.5mol/LIPTG诱导4h,回收菌体沉淀,进行160g/LSDSPAGE分析。再将pPROEXHTRpfdomain转化的DH5α接种于200mLLB培养液中扩大培养,经IPTG诱导后,5000r/min离心10min,弃上清,沉淀重悬于10mL盐酸胍裂解液中,室温缓慢摇动5～1

6、0min,至细胞完全裂解,冰浴条件下超声5次,每次10s,10000r/min离心10min,上清移至干净离心管。采用Invitrogen的Ni2+NTA纯化试剂盒,按照变性条件进行亲和色谱纯化,收集洗脱液进行160g/LSDSPAGE分析。　　1.2.2动物免疫将30只小鼠随机分为3组,每组10只。其中1组用纯化的融合蛋白免疫。另外2组分别为BCG对照组和生理盐水对照组。初次免疫采用皮下包埋的方法:将50μg融合蛋白滴于硝酸纤维素膜上,干燥后将硝酸纤维素膜包埋于实验组小鼠腹股沟皮下;2周后第2次免疫在另一侧腹股沟

7、皮下包埋;再过2周后50μg/只腹腔注射加强免疫。BCG免疫组每只小鼠于尾根部皮下免疫BCG0.1mg。生理盐水对照组每只小鼠皮下注射生理盐水100μL,最后1次免疫结束4周后,收集各组小鼠血清测定相应的抗体。同时每组取5只小鼠,测定其淋巴细胞增殖指数和细胞因子水平,另外5只小鼠用于毒株攻击实验。　　1.2.3免疫小鼠血清中特异性抗体的检测以纯化的融合蛋白作为抗原,包被ELISA板,4℃过夜,10g/LBSA37℃封闭30min,洗涤后加不同稀释度的免疫小鼠血清,37℃孵育1h,洗涤后加HRP标记的羊抗鼠IgG二抗孵育

8、1h。OPD显色后,测定A490值,以正常小鼠血清作阴性对照,P/N≥2.1为阳性。　　1.2.4抗原特异的脾淋巴细胞增殖实验分离各组小鼠的脾淋巴细胞,调整细胞密度为5×105/L,每孔200μL,在96孔板中用含100mL/LFCS的RPMI1640完全培养液中培养,同时每孔加入PPD2μg,对照孔不加PPD,调零孔不加脾细胞,