木聚糖酶的原核表达与鉴定和真核表达

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木聚糖酶的原核表达与鉴定和真核表达摘要:木实验通过克隆木聚糖酶基因到pTE28a表达载体上，转化BL21表达菌株，用IPTG诱导重组菌，跑SDS-PAGE后，在目的条带处冇0的蛋片的表达，用westernblot鉴定该蛋白，确信目的条带是目标蛋白。同时，把目的条带克隆到PPIC9K载体上，转化毕赤酵母表达菌株GS115,卬醇诱导重组酵母，测得木聚糖酶的活性可以达到2.375U/mLo关键字：木聚糖酶；原核表达；真核表达材料与方法菌种来源本实验所用菌种來自于华中农业人学农业微生物国家重点实验室。。。1.2培养基LB培养基：蛋白陈10g/L,酵母抽提物5g/L,氯化钠10g/L,pH7.0YPD培养基:蛋白B20g/L,酵母抽提物10g/L,葡萄糖20g/LBMMY培养基:蛋白月东20g,酵母抽提物:LOg,100ml13.4%YNB,2ml0.02%生物素,5g甲醇，100ml1M的磷酸盐缓冲液(pH6.0),定容至1L1.3菌种的活化将甘油管保存的含空载和口的基因的重组大肠杆菌表达菌株在含有50ug/mL的卡那霉索的固体LB培养基中划线，过夜培养，挑取单菌落到含有50ug/mL的卡那霉素的液体LB培养基中，培养至对数期，这就是活化的菌株。同时，将廿油管保存的含空载和目的基因的重组毕赤酵母GS115菌株在YPD固体平板上划线，培养至长出单菌落，挑取单菌落到YPD液体培养基中培养至对数期，备用。1.4重组菌的诱导表达1.4.1重组大肠杆菌的诱导表达按1%的接种量把活化好的重组大肠杆菌接到50ml的含有50ug/mL的卡那霉索的液体LB培养基中，37°C培养至0D600二0.6,添加终浓度为O.lmM的IPTG,25°C培养6-8h,离心收集菌体，加PBS溶液重悬破碎，再高速离心，取上清液过Ni柱，收集适当咪卩坐浓度洗脱的蛋白质，跑SDS-PAGE,并做westernblot验证目标蛋口。1.4.2重组酵母细胞的诱导表达按1%的接种量接种于20mlYPD液体培养基中，30°C,250r/min摇瓶16-18h,待OD6oo二2・6时，，5000r/min离心5min收集菌体，将菌体转入50mlBMMY培养基中(用500ml三角瓶，4层纱布封口)，250r/min摇瓶培养，每隔12h补充甲醇浓度至0.5-1.0%(w/v)进行蛋白的表达,并每隔12h取样lml,测ODeoo,离心保留上清备用。诱导96h后收集菌体，终止诱导，离心取上清备用。测定全部样品中木聚糖酶的活性。 1・5大肠杆菌表达的蛋白质的Ni柱纯化(1)固定鎳柱，滴完柱屮的乙醇，加3・5ml去离子水洗。(2)至少加5ml(—般为10ml)BindingBuffer平衡。⑶裂解液，即口标蛋口(预先用0.45um膜过滤)，加入柱中。(4)用10-15mlBindingBuffer洗。(5)洗脱,用含20mM、300mM和500mM的咪瞠的ElutionBuffer洗脱,收集300mM浓度的洗脱液。(6)用20%乙醇洗，再用其贮存係柱。1.6SDS-PAGE鉴定大肠杆菌表达的蛋白质及westernblot鉴定1.6・1SDS-PAGE配制分离胶浓度为12%和浓缩胶浓度为5%的SDS-PAGE,配制方式:12%分离胶配制(5ml):水1.6ml30%聚丙烯酰胺2ml1.5MTris-HCI(pH8.8)1.3ml10%SDS0.05ml10%过硫酸钱0.05mlTEMED0.002ml按这个顺序加入各种溶液，混匀后注入制胶板，加500ul水饱和的止丁醇封胶，待分离胶凝固后，倒掉止丁醇，配制浓缩胶。5%浓缩胶配制(2ml):水1.4ml30%聚丙烯酰胺0.33ml0.5MTris-HCI(pH6.8)0.25ml10%SDS0.02ml10%过硫酸鞍0.02mlTEMED0.002mln的蛋白洗脱液用两倍的上样缓冲液等体积混匀，沸水浴5min,上样电泳。80V电泳至分离胶，调节电压为120V,至溟酚蓝指示剂到胶最底部，停止电泳。小心取下分离胶，放入到染色液中染色30-45min,脱色至无背景蛋白条带清晰。162westernblot用GST蛋口做阴性对照，xynB蛋白为阳性对照。将样品和两个对照点样跑SDS-PAGE,电泳完成后切除多余的胶，转移到正点尼龙膜上，4°C下5%脱脂牛奶封闭过夜后，用His标签蛋白的抗体杂交，再用二抗与一抗杂交，DAB显色检测。1・7酵母表达上清液木聚糖酶活性的测定 1.7.1木聚糖酶活性标准曲线绘制a＞准确称取烘干至恒重的无水木糖150mg,用容量瓶定容至100ml,配制成10pmol/ml的木糖母液。b、用容量瓶将木糖母液稀释成1.0〜10.0|imol/ml的木糖标准液。c、分别取0.5ml的不同浓度的标准液于试管中，以水作为空白对照，分别加入lmlDNS试剂，沸水浴5mined、在540nm处测定各样品的吸光度，以吸光度为横坐标，对应的标准木糖溶液的浓度为纵坐标绘制标准曲线。1.7.2酵母发酵液木聚糖酶活性的测定收集重组酵母诱导发酵液，离心取上清液测定木聚糖酶的活性。测定方式为:精确吸取上清酶液0.05ml(每个样品3个平行)，置于50°C水浴预热2min。加入同样经预热的用柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)配制的1%木聚糖溶液0.45ml,于50°C水浴精确反应5min,迅速加入DNS液1ml终止反应，置沸水浴中5min。在540nm处测定各样品的吸光度，根据标准曲线计算反应液中还原糖的浓度，从而计算样品酶活性。精确吸取上清酶液0.05ml,先加入1mIDNS液使酶失活，加入1%木聚糖溶液0.45ml,同样置50°C水浴精确反应5min,取后在沸水浴5min,为阴性对照。记录540nm处各样品的吸光度，根据标准曲线计算反应液中还原糖的浓度，从而计算样品酶活性。2结果与分析2.1SDS-PAGE分析人肠杆菌表达的蛋白及westernblot验证结果M123M代表Marker,1.为GST蛋白,M1232为xynB蛋白，3为目的蛋白。2.2重组酵母表达的木聚糖酶结果 2.2.1木聚糖标准曲线2515••11O00.20.40.60.811.2ABS540酶活性标准曲线的冋归方程如下Y=1.657X+0.1141,R2=0.9814（其中Y代表木糖浓度，X代表吸光度），相关系数达到98%。该标准曲线可以用于木聚糖酶酶活性的测定。2.2.2酵母发酵液酶活性12345CK/ABS54o0.1290.1180.1190.1150.118样品/ABS54o0.1440.1640.2010.2530.288差值0.0150.0460.0820.1380.17酶活力单位（U/mL）0.8341.1421.5002.0572.375单位酶活性的定义为：50°C,pH5.0条件下，每分钟水解木聚糖生成相当于1pmol木糖等还原糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）。3讨论木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业屮。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及B■葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮屮的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。本实验采用犬肠杆菌和毕赤酵母表达木聚糖酶，实验检测都有木聚糖酶蛋白的表达，从而为未来工业上应用的木聚糖酶的来源捉供了一条简单易行的方式。本实验所用的木聚糖酶的基因来自于真菌，绝大多数的基因工程产品均是在大肠杆菌中表达实现的，这与其清楚的遗传背景不无关系。然而许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化，糖基化和甲基化等，大肠杆菌确实这种加工机制使得很多复朵的蛋白质往往不能在这个系统屮得到正确的表达。与大肠杆菌相比，作为单细胞真 核牛物的酵母菌同时具有了原核牛物的细胞牛长快速和易于培养的优点，同时乂具有真核生物表达蛋白质吋对蛋白质进行正确的加工的能力。由于酵母具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，近年來在复杂蛋白的表达方面越来越受到重视。Pichia.pastoris表达系统经过近十几年发展，已基木成为较完善的外源基因表达系统，由丁•易丁•高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点，同时利用强效可调控的A0X1启动子，已高效表达了HBsAg.TNF.EGF.破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源蛋白，并应用于工业化应用。本实验所用构建的木聚糖酶重组毕赤酵母菌株能成功的表达木聚糖酶，但酶的活性还比较低，在接下来的实验屮，我们会通过各种方法提高重组酵母表达的木聚糖酶的量，我们可以通过筛选多拷贝，修改信号肽序列，修正目的基因序列使得更适合毕赤酵母密码子的偏爱性，改善发酵条件等一系列条件得到更好的重组酵母。4参考文献［1］张桂敏，木聚糖酶基因的克隆、表达和酶学性质研究。［I■専士学位毕业论文］。武汉：华屮农业大学图书馆，2006⑵［美］SambrookJ等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社，2002⑶崔罗生等，黑曲霉木聚糖酶基因(xynA)在大肠杆菌屮的表达及酶学分析。华中农业大学学报,2009,28(1)：48-53［4］欧阳立明，张惠展，张嗣同。巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展。生物化学与生物物理进展,2000,27(2):151-154⑸黄君等，黑曲霉内切3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达。华中农业大学学报，2008,27(5)：611-615