《温州口岸病媒生物监测调查及两种重要病媒生物的转录组测序与分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
单位代码10635sssss学号112012327001922硕士学位论文温州口岸病媒生物监测调查及两种重要病媒生物的转录组测序与分析论文作者：高雪萌指导教师：王进军教授学科专业：农业昆虫与害虫防治研究方向：昆虫分子生物学提交论文日期：2016年05月26日论文答辩日期：2016年06月02日学位授予单位：西南大学中国重庆2016年06月 MasterdissertationSurveillanceofmedicalvectorsinWenzhouportandanalysisontwoimportantmedicalvectorsMSc.Candidate:Xue-MengGaoSupervisor:Prof.Jin-JunWangMajor:AgriculturalEntomologyandPestControlField:InsectMolecularBiologySouthwestUniversity,Chongqing,P.R.ChinaJune,2016 独创性声明学位论文题目：温州口岸病媒生物监测调查及两种重要病媒生物的转录组测序与分析本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：签字日期：2016年05月26日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：□不保密，□保密期限至年月止）。学位论文作者签名：导师签名：签字日期：2016年05月26日签字日期：2016年05月26日 本研究承蒙国家质检总局科研基金（2015IK303）浙江检验检疫局重点科研计划项目（2015-ZKZ-02）资助ThisstudywassupportedinpartbyResearchFundforGeneralAdministrationofQualitySupervision,InspectionandQuarantineofthePeople'sRepublicofChina（2015K303）andKeyResearchProjectsforZhejiangEntry-exitInspectionandQuarantineBureau(2015-ZKZ-02) 目录目录摘要.........................................................................................................................................IABSTRACT...................................................................................................................................I第一章文献综述......................................................................................................................11病媒生物的监测调查..............................................................................................................11.1病媒生物及虫媒传染病...................................................................................................11.2病媒生物的危害...............................................................................................................11.3开展病媒生物监测的意义...............................................................................................21.4口岸病媒生物研究的新方向...........................................................................................32转录组.....................................................................................................................................32.1转录组概述......................................................................................................................32.2转录组测序技术...............................................................................................................42.3转录组在昆虫中的运用...................................................................................................5引言...........................................................................................................................................9第二章温州口岸病媒生物本底调查......................................................................................111材料与方法...........................................................................................................................111.1口岸基本情况.................................................................................................................111.2监测对象........................................................................................................................111.3监测范围........................................................................................................................111.4监测时间........................................................................................................................121.5监测方法........................................................................................................................121.6标本鉴定........................................................................................................................131.7统计分析........................................................................................................................132结果与分析...........................................................................................................................132.1七里港码头结果与分析.................................................................................................132.1.1鼠形动物及其体表寄生虫（蜱、蚤、螨）..............................................................132.1.2蚊类.............................................................................................................................162.1.3蝇类.............................................................................................................................192.2温州龙湾国际机场结果与分析.....................................................................................222.2.1鼠形动物及其体表寄生虫（蜱、蚤、螨）..............................................................22 西南大学硕士学位论文2.2.2蚊类.............................................................................................................................262.2.3蝇类.............................................................................................................................282.2.4蜚蠊.............................................................................................................................313讨论......................................................................................................................................343.1温州七里港码头.............................................................................................................343.2温州龙湾国际机场.........................................................................................................37第三章温州口岸输入性病媒生物的监测调查.......................................................................411材料与方法...........................................................................................................................411.1监测对象........................................................................................................................411.2监测种类及侵害阳性指征.............................................................................................411.3监测时间........................................................................................................................411.4监测方法........................................................................................................................421.5标本鉴定........................................................................................................................422结果与分析...........................................................................................................................432.1入境集装箱卫生检疫情况.............................................................................................432.2入境集装箱截获病媒生物的来源.................................................................................472.3入境集装箱截获病媒生物的密度变化.........................................................................472.4入境船舶卫生检疫情况.................................................................................................502.5入境船舶截获病媒生物来源地分布.............................................................................522.6入境船舶截获病媒生物密度变化.................................................................................532.7入境航空器及国际邮包媒介截获情况.........................................................................553讨论......................................................................................................................................553.1入境集装箱截获病媒生物.............................................................................................553.2入境船舶截获病媒生物.................................................................................................56第四章黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组分析..........................................................................571材料与方法...........................................................................................................................571.1试验材料........................................................................................................................571.3试验方法........................................................................................................................572结果与分析...........................................................................................................................602.1黑胸大蠊转录组分析.....................................................................................................60 目录2.2澳洲大蠊转录组分析.....................................................................................................663讨论......................................................................................................................................69第五章主要结果、结论及研究展望......................................................................................73参考文献..................................................................................................................................77在读期间发表的文章...............................................................................................................85致谢.........................................................................................................................................87 摘要摘要病媒生物是传染病传播的重要载体，它不仅在某一地区和国家发生危害，更可借助交通工具、集装箱、货物、邮件等在国际口岸间传播，对口岸地区的卫生安全造成严重威胁。浙江温州七里港码头和温州龙湾国际机场是浙南地区的重要国际港口，近年来出入出交通工具、人员、集装箱发展迅速，加之黄热病、寨卡病毒等虫媒传染病暴发，使疫情传入我国的风险不断增加。本学位论文为有效防止病媒生物及虫媒传染病经国境口岸传入和传出、维护国门生物安全，于2012-2015年在温州七里港口岸和温州龙湾国际机场系统地收集病媒生物，获得了温州口岸病媒生物的种类、数量、分布和季节变化等资料。同时，面对口岸病媒生物防控工作的新挑战，本学位论文利用高通量测序技术对重要病媒生物黑胸大蠊PeriplanetafuliginosaServille和澳洲大蠊P.australasiae(Fabricius)进行了转录组测序和初步分析工作，旨在为今后深入开展相关研究提供基础数据。主要结果如下：1．温州口岸病媒生物本底调查2012-2015年间，在温州七里港码头共捕获病媒生物标本18866号，隶属9科23属33种。其中，鼠形动物72号，隶属2科4属6种，各年度平均密度分别为0.78%、1.31%、0.71%和0.46%，9月和12月是活动高峰期，优势种为臭鼩鼱Suncusmurinus(Linnaeus,1766)，占比75.00%。蚊类5436号，隶属2科4属6种，各年度平均密度分别为4.04号/(台*小时)、7.93号/(台*小时)、8.37号/(台*小时)和6.15号/(台*小时)，夏季为活动的高峰时期，优势种为致倦库蚊CulexpipiensquinquefasciatusSay,1823，占比69.24%。蝇类13355号，隶属4科14属20种，各年度平均密度分别为104.00号/笼、253.80号/笼、151.94号/笼和274.50号/笼，活动高峰为7月，以大头金蝇Chrysomyiamegacephala(Fabricius,1724)、丝光绿蝇Luciliasericata(Meigen,1826)为主，分别占比50.85%和28.79%。2012-2015年间，在温州龙湾国际机场共捕获病媒生物标本35515号，隶属10科19属29种。其中鼠形动物95号，隶属2科4属6种，各年度平均密度为1.08%、0.91%、1.67%和0.72%，高峰期集中在6-8月，优势种为臭鼩鼱，占比42.11%。蚊类5342号，隶属2科3属5种，各年度平均密度分别为6.56号/(台*小时)、7.49号/(台*小时)、7.47号/(台*小时)和3.22号/(台*小时)，活动高峰集中在夏季，优势种为致倦库蚊，占比74.22%。蝇类20423号，隶属4科10属14种，各年度平均密度分别为312.61号/笼、257.00号/笼、276.67号/笼和288.33号/笼，活动高峰时期为7月，以大头金蝇和丝光绿蝇为主，分别占比59.91%和24.29%。蜚蠊9655I 西南大学硕士学位论文号，隶属2科2属4种，各年度平均密度分别为8.36号/张、8.89号/张、8.83号/张和5.88号/张，发生高峰期为5-6月，优势种为德国小蠊Blattellagermanica(Linnaeus,1767)，占比96.99%。2．温州口岸输入性病媒生物调查2012-2015年间，在温州口岸入境集装箱共截获输入性病媒生物标本823号，隶属4目10科19属31种，以蝇类为主，占80.07%，其次为蜱（10.57%）和蜚蠊（8.51%），蚊类和鼠类占比较少。截获病媒生物的集装箱来源于35个国家和地区，其中占比最高的5个国家和地区为：宁波内支线、南非、美国、乌拉圭和澳大利亚，货物主要为盐湿牛皮。截获病媒生物的高峰集中在6-10月。发现9种非本地种的输入性病媒生物，分别为绯胫纹蝇GraphomyarufitibiaStein,1918、厚环黑蝇OphyraspinigeraStein,1910、巴浦绿蝇Luciliapapuensis(Macquart,1842)、古铜黑蝇Ophyraaenescens(Wiedemann,1830)、凯氏酪蝇Piophilacasei(Linnaeus,1758)、蓬勃花蜱AmblyommapomposumDönitz,1909、图兰璃眼蜱HyalommaturanicumPomerantsev,1946、丽表花蜱Amblyommalepidum(Dönitz,1808)和彩饰花蜱Amblyommavariegatum(Fabricius,1794)。2012-2015年间，在温州口岸入境船舶上共截获输入性病媒生物标本80号，隶属2目6科10属14种，主要包括蝇类和蜚蠊，分别占52.50%和47.5%。截获病媒生物的船舶来源于10个国家和地区，船港籍为中国、中国香港和巴拿马的船舶携带输入性病媒生物较多，截获高峰主要集中在5-6月和9-10月。发现3种非本底种的输入性病媒生物，包括蓝翠蝇、厚环黑蝇和凯氏酪蝇。3．黑胸大蠊和澳洲大蠊转录组分析利用illumina测序技术对黑胸大蠊PeriplanetafuliginosaServille,1839和澳洲大蠊Periplanetaaustralasiae(Fabricius)进行了转录组测序。其中，黑胸大蠊转录组信息数据量为13.63G，共获得54964个转录本，总长度57753395bp；进一步分析后获得39576个unigene基因，总长度32297597bp，最长27693bp，平均长度816bp。将unigene依次在Swiss-Prot、NR、KEGG、COG和Pfam等公共序列数据库进行比对，共获得61167个注释结果。黑胸大蠊SNP置换（transition）33955个，颠换（transversion）16561个，筛选获得2666条微卫星序列。澳洲大蠊转录组信息数据量为7.19G，共获得29160个转录本，总长度21385175bp；进一步分析后获得24404个unigene基因，总长度16583410bp，最长10853bp，平均长度679bp。将unigene在Swiss-Prot、NR、KEGG、COG和Pfam等公共序列数据库进行比对，共获得45476个注释结果。澳洲大蠊SNP置换（transition）21234个，II 摘要颠换（transversion）11154个，筛选获得1543条微卫星序列。关键词：病媒生物；监测；黑胸大蠊；澳洲大蠊；转录组III AbstractAbstractMedicalvectorsareimportantintermediaryinpathophoresis.TheMedicalvectorsthreattopublichealth,evencanspreadtotheworldwiththehelpofship,airplane,container,cargoorparcel.WenzhoulongwaninternationalairportandWenzhouqiligangportareimportantportsinsouthofZhejiangprovince.WiththenumberofEntry-exitvehicle,containerorpassengerincreasedrapidlyintheseports,theriskofthevector-bornediseaseincreased.Variousmedicalvectorsspreadvariouspathogensorhavedifferentruleofthedevelopment.It’sveryimportanttosurveymedicalvectorinfrontierport.Thepaperpurposeonpreventingmedicalvectorsorthepathogensenterorexitfromfrontierport,early-warninginsect-borneinfectiousdiseaseandmaintainbiologicalsafety.Ourresearchsurveyedthemedicalvectorsperenniallyandobtainedthespecies,number,structureandseasonalfluctuationofmedicalvectorsinWenzhouPort.Meanwhile,theresearchusedhigh-throughputsequencingtechnologytoobtainthetranscriptomeofP.Fuliginosa(Serville)andP.australasiae(Fabricius)tosolvenewprobleminmedicalvectorscontrol.ThetranscriptomeofP.fuliginosa(Serville)andP.australasiae(Fabricius)areusefulforfurthermolecularresearch.Mainfindingsareasfollows:1.SurveillanceofmedicalvectorsinWenzhouportAtotalof18866medicalvectorswerecapturedinWenzhouqiligangportfrom2012to2015,identifiedas33species23generaand9families.Captured72rodents,whichwereidentifiedas6species4generaand2families.Thedensityofrodentswere0.78%,1.31%,0.71%and0.46%,respectively.ThepeakperiodofrodentappearedinSeptemberorDecember,thedominantspeciesofrodentswasSuncusmurinus,accountingfor75.00%.Captured5436mosquitoes,whichwereidentifiedas6species4generaand2families.Thedensityofmosquitoeswere4.04,7.93,8.37and6.15perlamp-hour,respectively.ThedominantspeciesofmosquitoeswasCulexpipiensquinquefasciatus,accountingfor69.24%,withthepeakperiodinSummer.Captured13355flies,whichwereidentifiedas20species14generaand4families.Thedensityofflieswere104.00,253.80,151.94and274.50percage,respectively.FilespeakinJulywiththedominantspeciesofChrysomyiamegacephalaandLuciliasericata,accountingfor50.85%and28.79%respectively,withthepeakperiodinJuly.I 西南大学硕士学位论文Atotalof35515medicalvectorswerecapturedinWenzhoulongwaninternationalairport,identifiedas29species19generaand10families.Captured95rodents,whichwereidentifiedas6species4generaand2families.Thedensityofrodentwere1.08%,0.91%,1.67%and0.72%,respectively.ThepeakperiodofrodentappearedfromJunetoAugust,thedominantspeciesofrodentwasSuncusmurinus,accountingfor42.11%.Captured5342mosquitoes,whichwereidentifiedas5species3generaand2families.Thedensityofmosquitoeswere6.56,7.49,7.47and3.22perlamp-hour,respectively.ThedominantspeciesofmosquitoeswasCulexpipiensquinquefasciatus,accountingfor74.22%,withthepeakperiodinSummer.Captured20423flies,whichwereidentifiedas14species10generaand4families.Thedensityofflieswere312.61,257.00,276.67and288.33percage,respectively.FilespeakinJulywiththedominantspeciesofChrysomyiamegacephalaandLuciliasericata,accountingfor59.91%and24.29%,respectively.Captured9655Cockroaches,whichwereidentifiedas4species2generaand2families.ThedensityofCockroacheswere8.36,8.89,8.83,5.88pergluetrap,respectively.Cockroacheswereobservedthroughoutthewholeyear,thepeakperiodappearedinMayorJune,thedominantspecieswasBlattellagermanica,accountingfor96.99%.2.ExoticmedicalvectorsinterceptedatWenzhouportAtotalof823medicalvectorswereinterceptedinexoticcontaineratWenzhouport,whichwereidentifiedas31species19generaand10families.Themajormedicalvectorswereflies,accountingfor80.07%,whichfollowedbytickandCockroaches,accountingfor10.57%and8.51%,respectively.Fewrodentsandmosquitoeswereintercepted.Thecontainerwhichhaveinterceptedmedicalvectorsweredistributedin35countriesorregions,withNingbo(feederliner),SouthAfrica,America,UruguayandAustraliabeingthemajorones,themajorcargowaswet-saltedbovinehide.ThepeakperiodappearedfromJunetoOctober.8specieswerefoundinthesemedicalvectorswhichdoesn'tbelongtolocalspecies,identifiedasGraphomyarufitibia,Ophyraspinigera,Luciliapapuensis,Ophyraaenescens,Piophilacasei,Amblyommapomposum,Hyalommaturanicum,AmblyommavariegatumandAmblyommalepidum.Atotalof80medicalvectorswereinterceptedinentershipatWenzhouport,whichwereidentifiedas14species10generaand6families.ThemajormedicalvectorswerefliesandCockroaches,accountingfor52.50%and47.5%respectively.Theshipwhichhaveinterceptedmedicalvectorsfrom10countriesorregions,themajorII AbstractoneshavetheflagofCHINA,HONGKONGandPANAMA.ThepeakperiodappearedfromApriltoJuneandSeptembertoOctober.3specieswerefoundinthesemedicalvectorswhichdoesn'tbelongtolocalspecies,identifiedasNeomyiatimorensis,OphyraspinigeraandPiophilacasei.3.ThetranscriptomeofPeriplanetafuliginosaServilleandPeriplanetaaustralasiae(Fabricius)TheresearchcarriedoutdenovoassemblyoftheP.fuliginosaandandP.australasiaetranscriptomeusingIlluminasequencing.InP.fuliginosa,weobtained54964transcriptswiththelengthof57753395bp,whichfurtherassembledinto39576unigenewiththelengthof32297597bp.BasedonSwiss-Prot,NR,KEGG,COGandPfam,61167genehavebeenidentifiedwithfuctions.Atotalof33955transitionsand16561transversioninSNPwereidentified;2666EST-SSRswereidentified.InP.australasiae,weobtained29160transcriptswiththelengthof21385175bp,whichfurtherassembledinto24404unigenewiththelengthof16583410bp.BaseonSwiss-Prot,NR,KEGG,COGandPfam,45476genehavebeenidentified.Atotalof21234transitionsand11154transversioninSNPwereidentified;1543EST-SSRswereidentified.Keywords:medicalvectors;Surveillance;Periplanetafuliginosa;Periplanetaaustralasiae;transcriptomeIII 第一章文献综述第一章文献综述1病媒生物的监测调查1.1病媒生物及虫媒传染病病媒生物原称医学媒介生物，根据《中华人民共和国传染病防治法》的定义：病媒生物是指能够将病原体从人或其他动物传播给人的生物，如蚊、蝇、蚤类等。它们具有传播某些种类传染病、贮存某些种类传染病病原体作用。常见的鼠、蚊、蝇、蜚蠊、蚤、蠓、蜱和螨是国家出入境检验检疫行业标准中规定的应监测的8种病媒生物。由病媒生物传播的疾病称为虫媒传染病。例如，《国境卫生检疫法》规定的检疫传染病中的鼠疫、黄热病和监测传染病中的登革热、疟疾以及多种病毒性出血热、流行性乙型脑炎等都是虫媒传染病。有些病媒生物常孳生于人畜居住处附近，能通过机械携带等方式来污染食物、水和生活用品，进而传播疾病，尤其是肠道传染病，如蜚蠊、蝇等。有些病媒生物通过叮咬的方式将体内病原传入宿主，如蚊、蜱、蠓、蚤等。1.2病媒生物的危害病媒生物是国际传染病传播的重要载体，由病媒生物传播的病原体包括病毒、立克次体、细菌、螺旋体、原虫及蠕虫等，所引发的疾病约占人类传染病总数的三分之二。当外界条件（如地理环境、气候、病原寄主）适宜时，病媒生物可以将病原体在人群中不断传播，造成疾病快速暴发，甚至夺去人的生命。每年全球[1]约400种病媒生物造成大约5000万人染病，直接经济损失达2000亿美元。据报道，至2009年，我国国境口岸已发现并且确认的上述8类病媒生物已有640余种[2]。病媒生物不仅在某一地区和国家危害，随着国际交流，病媒生物及其携带的病原体可借助交通工具、集装箱、货物、邮件等在国际口岸间传播，使原本局限于一定地域内的虫媒传染病突破国境或自然地理的界限，对输入国的卫生安全特[3,4]别是口岸地区的卫生安全造成极大的威胁。由病媒生物传播的虫媒传染病是一类重要的传染病，近20年来新发现的30余种传染病中，许多是由病媒生物传播的。目前我国法定传染病有37种，其中肾综合出血热、疟疾、登革热、登革出血热等13种疾病由病媒生物传播。历史上多次发生由于病媒生物的入侵造成疾病爆发流行的事例。1930年，冈比亚按蚊（Anophelesgambiae）随邮船从西非的塞内加尔输入到巴西，并在巴西东北部大量孽生繁殖，导致巴西1939至1940年的疟1 西南大学硕士学位论文疾爆发流行，约23万人发病，死亡3400人。近30年来，西欧已发生63起“机[5]场疟疾”事件，均是由病媒生物通过飞机传至当地并引发疾病。1998年，染有鼠疫杆菌的褐家鼠通过船舶从印度被带往马达加斯加，并在该岛大量繁殖，随后该岛开始出现鼠疫，至今仍频繁发生。可见，如不能在国境口岸有效防控病媒生物，将会对国家带来重大的危害。1.3开展病媒生物监测的意义近年来，国际虫媒传染病发生频繁、影响重大。2008年，我国发现首例输入性基孔肯雅热病例。2013年，我国多个口岸从柬埔寨、老挝、印度等国家入境的人员中发现52例输入性疟疾病例。2013年，哥斯达黎加、马来西亚、新加坡等多地爆发登革热疫情，病例数高达11万人；新加坡爆发基孔肯雅热疫情，病例数千人以上。2013年9月，巴基斯坦爆发克里米亚-刚果出血热，死亡率高达19.5%。2014年1月，马达加斯加共和国爆发鼠疫，致死50余人。2014年，重庆检验检疫局在重庆江北机场入境的人员中，发现印度尼西亚、新加坡旅游归国28人团组中，8人聚集性感染登革热病毒疫情。2004-2012年间，温州口岸累计报告境外输入性疟疾病例108例。可见，随着国际间交流的日益频繁和国际疫情的持续，由国际交通运输工具及其传输的染病人员、集装箱及货物所携带的输入性病媒生物造成的传染病在国家间传播流行的风险急剧增加。特别是“一带一路”发展战略的提出，对我国输入性疫情的挑战越来越严峻。研究表明，入境国际船舶和集装箱携带病媒生物具有来源广、数量大、种类多、风险高的特点，并且其中多数为[2]重要的传病媒介种类。全球范围的多种虫媒传染病的发生威胁我国的国门安全和人民群众的身体健康，影响我国国民经济的快速发展和社会的和谐稳定。[2]另一方面，随着全球气候变暖，病媒生物孳生栖息环境不断扩大。我国气候条件丰富，跨越寒温带、温带、暖温带、亚热带、热带5个气候带，病媒生物突破自然地理限制后极有可能在我国定殖，多样性的生态环境更易受到入侵种的侵害，对我国的生物多样性、农林牧渔业生产以及人类健康造成经济损失。据统计，目前已有400多种外来物种入侵我国，在国际自然保护联盟（IUCN）公告的100[6]种国球最具威胁的外来物种中，我国就有50余种。其中最著名的入侵病媒生物当属德国小蠊（Blattellagermanica）该入侵物种于20世纪80年代初在商品流通的过程中入侵我国，由于缺乏天敌，再加上其顽强的适应能力，目前已成为我国城市蜚蠊的绝对优势种群，对居民生活造成极大影响。外来入侵物种给我国造成的损失高达198.59亿元，而其中有病媒生物入侵造成的人类健康损失约29.21亿元，仅褐家鼠（Ratusnorvegicus）造成的损失就达10亿元以上。加之入侵种对我国物种资源、生态系统造成的间接损失，大约占国内2 第一章文献综述[7]生产总值的1.36%。因而，在口岸地区开展病媒生物监测调查具有重大意义，可以第一时间掌握病媒生物发展动态，了解种群构成的变化、季节消长情况、密度、携带病原情况等信息，为科学防治虫媒传染病、防范生物入侵提供重要的数据支撑。1.4口岸病媒生物研究的新方向随着口岸的进一步扩大开放，病媒生物防控工作面临新形势下的新挑战。一是传统生物学鉴定方法耗时、人力成本高、限制于样本的发育阶段、性别和完整度，在快速通关、应对非技术性贸易壁垒方面显现了弱势；二是国际疫情疫病多发频发，特别如利什曼病、登革热、寨卡热等虫媒传染病在近年来多次暴发，面对这些国内少见的疫情疫病，如何有效检出成为了发展的关键问题；三是口岸以化学防治为主，所产生的“3R”问题日益突出，同时口岸主要熏蒸剂溴甲烷将逐步退出使用，对病媒生物防控方法提出了新的要求。而快速发展的分子生物学技术为口岸病媒生物研究打开了新的突破口。利用DNA信息对生物进行种类鉴定、物种分类地位及种间亲缘关系探讨正在成为一个[8-13]主流手段，受到学术界、各国政府检疫机构、相关协会受到高度关注。近年来，分子生物学技术在口岸病媒生物鉴定上的运用成为新兴热点，诸多口岸研究者对[14,15]其前景看好。有研究者通过DNA条形码技术对黑线姬鼠（Apodemusagrarius）[16-19][20-22]等小型兽类、对多种携带入境的蚊类进行了分类鉴定，并取得了较好效[23-25][26-28]果。同时，分子生物学在研究昆虫抗药性、病原体鉴定等方面均展现了其优势。黑胸大蠊PeriplanetafuliginosaServille和澳洲大蠊Periplanetaaustralasiae(Linnaeus)是我国重要的病媒生物，是南方常见的大蠊种类，适应能力、繁殖能力、行动能力很强，能机械携带痢疾杆菌、大肠杆菌等肠道传染病病原体、病毒、霉菌和蛔虫卵，对公共卫生安全造成影响。但目前对这两种蜚蠊的分子生物学研究却不多，对其分子生物学信息知之甚少。利用转录组技术对这些非模式昆虫的转录组进行的测序，对于物种分子鉴定、病原体的分子生物学、抗药性或者防控机制研究等方面均有重要的助推作用。2转录组2.1转录组概述转录组广义是指生物在某一生理条件下，特定细胞内或者某个物种转录的所有产物（rRNA、nRNA、tRNA、mRNA）的总和；狭义上是指所有mRNA的总和，3 西南大学硕士学位论文[29;30]包括非编码的RNA和mRNA。mRNA是由DNA转录而来，携带相应的遗传信息，为蛋白质翻译提供所需的信息。转录组所包含的的产物，有一定的时间、空间限制，同一细胞或者生物，在不同的生长阶段或不同的生存条件，其转录组[31]不同。转录组学（transcriptomics）是一门基于转录组在整体水平之上研究生物基因转录情况的学科。转录组学作为功能基因组学重要的组成部分，其应用层面越来越丰富，特别是在揭示基因表达、生命活动和生理规律方面发挥着重要的作用。与全基因组测序（费用高昂）和蛋白质组学（技术难度大）相比，转录组测序能够在核苷酸水平上对指定生物或细胞的整体转录情况进行测序，得到全部RNA转录本的丰度信息，且准确度极高，这使得转录组研究具有十分广泛的应用范围。转录组研究打破了选定单个基因或少数几个基因作为研究对象的传统模式，在整体水平上展现基因的动态变化，将生物的功能基因组学带入了一个新的高速发展时期。2.2转录组测序技术转录组测序技术最初是由基因表达系列分析技术（SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE）和大规模平行测序技术（MassivelyParalelSignatureSequencing,MPSS）为代表的第一代测序技术发展到第二代测序技术——高通量测序技术（High-throughputsequencing），直至目前第三代单分子、高通量测序技术。2.2.1第一代测序技术基因表达系列分析技术（SAGE）是一种开放的、高效的分析细胞基因表达状态的第一代转录组测序方法，测序过程中不需要任何序列信息，能够检测到所有[32]基因的表达水平，兼具指示基因差异表达谱和对未知低拷贝基因的发现作用。大规模平行测序技术（MPSS）是基于短标签测序的方法，是SAGE技术的改进方法，可以获得更长的短标签序列，因而具备更高的测序精确度。而且其特有[33]的微球荧光测序技术，可直接高通量读出序列，使转录组的测序过程更为简化。[34][35;36]第一代测序技术以双脱氧终止法和化学降解法为基础。双脱氧终止法是利用ddNTP在DNA合成中磷酸二酯键不能形成的原理，通过放射自显影技术和凝胶电泳，根据电泳结果确定待检测的DNA序列。化学降解法是用特殊的化学药剂标记碱基，然后待测序列用化学方法打断，通过电泳读出序列。2.2.2第二代测序技术相比于第一代测序的高成本、长周期、低通量，第二代测序技术（高通量测序技术）具有明显的优势。其原理为提取样品总RNA后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，再利用fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段。用六碱基随机引物以mRNA为模板，合成第一条cDNA链，然后加入dNTPs、缓4 第一章文献综述冲液、DNApolymeraseⅠ和RNaseH合成第二条cDNA链，纯化洗脱后做末端修复并加poly(A)以及连接测序接头。片段大小用电泳进行选择后扩增，用高通量测[37]序平台进行样品文库的深度测序，后经图像识别，获得DNA序列。二代测序技术运用类似于一代测序技术的理念，既保持测序的高准确度，也提高了测序速度，极大降低了测序成本。二代测序技术主要包括Roche454焦麟酸测序技术、Illumina/Solexa测序技术、Solexa测序技术和SOLiD测序技术等。2.2.3第三代测序技术第二代测序技术在各类生物领域均得到广泛的应用，但是测序成本和准确度的问题仍然存在。为了进一步解决这些问题，第三代测序技术应运而生。第三代测序技术包括He-licos单分子测序仪、PacificBioscience的SMRT技术以及OxfordNanoporeTechnologies公司的纳米孔单分子测序技术。第三代分子测序技术代表的是高通量、低成本、长读段。在方法上，第三代测序技术不需要依赖DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序，也就是说不需要进行PCR扩增就可以完成测序。该测序技术大大提高了仪器的灵敏度和加强了的荧光信号的强度，这样可以[38]减少测序过程中错误率，该技术已经逐渐被研究者所关注。2.2.4RNA测序技术在二代转录组测序方法中，RNA测序技术（RNAsequencing,NA-Seq）即转录组测序出现较晚。它基于第二代测序技术的转录组学研究方法，可以全面了解该生物样品当前状态下的基因表达状况。如果有对照组，则可以和对照组生物样品的RNA-Seq转录组进行比较，可在转录组层面得到全部的基因表达情况，清晰地了解全部基因上调及下调的状态，进而形成表达谱。研究者针对所关注的关键基因则可以形成所需基因的pathway构建。RNA-seq能够发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供更为全面的转录组信息。2.3转录组在昆虫中的运用[39][40]目前，转录组在昆虫中主要用于代谢途径分析、新基因发掘、功能基因[41][42][43]发现、基因差异表达研究和分子标记的筛选等方面。2.3.1分类与进化单个的基因数据信息量不充沛，难以重现复杂的生物进化过程。而从数据量的角度，利用转录组测序能够获得多个基因片段消除这种随机误差，能为推断系[44]统发育关系提供更加可靠的帮助。分子标记是基于个体间遗传物质内核苷酸序列变异的遗传标记，直接反映DNA水平的遗传多样性。利用新一代测序技术对昆虫进行分子标记的研究，可有5 西南大学硕士学位论文[45]效助推昆虫分子标记的开发，如单核苷酸多态性（SNPs）和微卫星（SSRs）等。2.3.2行为生态学[46]昆虫的行为及其发生机制一直是国际研究的热点，利用转录组数据研究昆虫的行为生态学已有许多报道。如国外学者探究了巨蚊属蚊类同致倦库蚊、埃及伊蚊、冈比亚按蚊的基因组差异，发现巨蚊属蚊类编码气味分子受体蛋白和离子转移受体蛋白的基因表达量和丰度均低于其他三种蚊类，这可能是造成巨蚊属不[47]吸血的原因。学者通过RNA-seq技术探究了白纹伊蚊Aedesalbopictus(Skuse,1894)和埃及伊蚊Aedesaegypti(Linnaeus,1762)两种蚊类滞育方式在分子水[48]平上的差别，为彻底认识白纹伊蚊和其他媒介昆虫滞育现象奠定了基础。2.3.3基因差异表达研究大量的研究表明，昆虫在不同发育时期基因表达的种类、表达量等均不相同，基因的选择性表达是机体整个生命过程的决定性因素。因此阐明不同发育时期、不同环境及不同状态下昆虫基因的表达差异有助于了解生物生命的奥秘，有助于功能基因的确定，为防治各类有害生物提供理论依据。如对小菜蛾（Plutellaxylostella）幼虫被弯尾姬蜂（Diadegmasemiclausum）寄生后的数小时转录表达情[49]况进行研究，发现900余种基因表达水平有明显差异。对昆虫生长发育的研究一直以来都是研究者重点关注的领域。大多昆虫具有快速发育和蜕皮变态的特征，多数昆虫在数周之内体重增加约1000倍。而随着快速生长发育，导致昆虫取食量提升，同时昆虫通过变态发育获得更强的环境适应能力和更加强大的移动能力，从而使其造成的危害更为严重。随着分子生物学的发展，研究者陆续鉴定了多种与生长发育相关的基因。但昆虫的生长发育是一个极其复杂的过程，涉及到整个机体的协同运作，不仅仅是少数基因作用的结果，所以对少量基因的研究和探索无法完全阐释昆虫生长发育的机制。而新一代的转录组测序为研究者提供了昆虫生长发育基因表达和调控的大数据平台，通过对转录组测序的广泛应用，为全方位解析昆虫生长发育的基因调控提供了可能，也为有害生物防控提供了更多思路。如利用Illumina测序平台对稻纵卷叶螟[50][51]（Cnaphalocrocismedinalis）和斜纹夜蛾不同发育阶段转录组测序，发现上千基因表达量发生了变化。2.3.4新基因发掘Graveley等利用RNA-seq技术，对不同性别黑腹果蝇的1龄、3龄和5龄幼虫、蛹、成虫等30个不同的发育阶段的转录组和表达谱进行测序，发现了一系列调控性别特征形成的基因，并发现111195个新的功能元件，包括数以千计的基因、[40]编码和非编码转录子、外显子、剪接和编辑等。通过飞蝗(Locustamiratoria)转录组测序，发现了具有代表性的核心基因集。通过与其他8种已测序昆虫进行比6 第一章文献综述[52]较基因组学分析，鉴定出不完全变态和完全变态的昆虫的基因组分歧。对埃及伊蚊（Aedesaegypti）胚胎运用Ilhimina测序发现了2个新的受精卵激动蛋白轻链[53]基因，并证明在蚊子的早期受精卵中这2个基因就开始表达。上述研究结果表明，基于新一代测序技术的转录组测序分析，特别有利于在非模式生物和具有复杂基因组的物种发现新的基因，大大拓宽了研究的广度。2.3.5昆虫对非生物逆境的影响昆虫对非生物逆境（如低温、高温、农药等）适应性的高低，对其种群的生存和发展至关重要。昆虫在基因水平对非生物逆境的响应和适应，逐渐成为了研究热点。与昆虫生长发育一样，昆虫对非生物逆境的响应也由大量基因协同调节。新一代测序技术为从转录组水平上开展昆虫对非生物逆境响应机制提供了强大工具，尤其是在抗药性研究领域为研究者打开了新的思路。近年来，各类有害生物的抗药性随着杀虫剂的大量、广泛、持续使用而快速发展，以至于造成有害生物对人类和作物的危害日益加重，给社会造成了重大经济损失。因此，昆虫抗药性研究不仅作为生物对环境适应进化的重要科学问题，也作为关乎社会经济可持续发展的重要社会问题，基于新一代测序技术的昆虫转录组测序可以为昆虫抗药性[46]研究带来重大变革。7 西南大学硕士学位论文8 引言引言温州，属浙江省辖地级市，介于北纬27度03分至28度36分、东经119度37分至121度18分之间，为中亚热带季风气候区，冬夏季风交替显著，温度适中，四季分明，雨量充沛。年平均气温17.3-19.4℃，1月份平均气温4.9-9.9℃，7月份平均气温26.7-29.6℃。年降水量在1113-2494毫米之间。春夏之交有梅雨，7-9月间有热带气旋，无霜期为241-326天。年日照数在1442小时-2264小时之间。陆地海岸线长355千米，海岸线曲折，形成天然良港，海域面积约11000平方公里。1957年2月21日，国务院正式批准温州为准许外国籍船舶进出的18个沿海港口之一，温州成为当时浙江省唯一对外开放的港口。七里港位于瓯江入口处，具有港阔、水深、浪小、不淤、不冻的特点，是天然深水良港。码头拥有2.5万吨级多用途泊位、1.5万吨级集装箱专用泊位等不同吨级的泊位4个，总占地面积405222亩，集装箱堆场面积90000m，拆装箱库面积5000m，煤炭堆场30000m，钢材2堆场5000m。温州龙湾国际机场于2012年7月24日成为一类对外开放口岸。其地处温州市龙湾区，濒临东海，距市行政中心约22km，辐射温州、台州、丽水和宁德四个2地区约160000km、2000多万人口，周边300km范围内没有大型机场，是大陆离台湾空中航距最近的机场，航程头有50多分钟。2014年温州龙湾国际机场旅客吞吐量在全国202个民用机场中排名第32位，省内民用机场居第2位；截至2015年6月底，累计通航城市96个，其中国际（地区）城市19个；签约航空公司40家，其中国航、东航、南航设有过夜基地，过夜停场飞机10架。近年来温州入出境业务持续发展，2012-2015年，温州入出境集装箱54.95万标箱，其中入境28.52万标箱，出境26.43万标箱，年均增长5.52%；入出境船舶1407艘，其中入境674，出境733，年均增长率9.55%；入出境航空器8712艘，其中入境4330，出境4382，年均增长率35.86%；入出境人员113.94万人次，年均增长率59.13%。病媒生物是传染病传播的重要载体，它不仅在某一地区和国家危害，更可借助交通工具、集装箱、货物、邮件等在国际口岸间传播，对口岸地区的卫生安全造成威胁。温州七里港码头和温州龙湾国际机场是浙南地区的重要国际港口，近年来入出境交通工具、人员、集装箱发展迅速，这使得各类虫媒传染病输入我国的风险不断增加。由于不同病媒生物所携带的病原，其危害和发生发展规律均不相同，因而开展国境口岸病媒生物监测工作十分重要。本学位论文为有效防止病媒生物及其传播的虫媒传染病经国境口岸传入传出，科学预警虫媒传染病的发生、发展和流行，维护国门生物安全，于2012-20159 西南大学硕士学位论文年在温州七里港口岸和温州龙湾国际机场长期、连续、系统地收集病媒生物，获得了温州口岸病媒生物的种类、数量、分布和季节变化等资料。同时，面对口岸病媒生物防控工作的新挑战，本学位论文利用高通量转录组测序技术对口岸重点关注病媒生物黑胸大蠊PeriplanetafuliginosaServille和澳洲大蠊Periplanetaaustralasiae(Fabricius)进行了转录组测序和初步分析，旨在为今后深入开展相关研究提供基础数据。本学位论文框架主要分为三个部分：1.对温州七里港码头和温州龙湾国际机场的病媒生物进行本底调查，获得温州口岸病媒生物的种类、数量、密度和季节变化等资料。2.对温州输入性的病媒生物进行监测，获得其种群、数量、来源、载体等信息。3.对黑胸大蠊和澳洲大蠊进行转录组测序，得到其全转录本信息，并在各数据库进行比对注释、开发EST-SSR、SNP等分子标记。10 第二章温州口岸病媒生物本底调查第二章温州口岸病媒生物本底调查病媒生物可传播病毒、立克次体、细菌、螺旋体、原虫及蠕虫等病原体，所引发的疾病约占人类传染病总数的三分之二。随着国际交流的日益频繁，携带病原体的人或病媒生物可借助国际运输载体输入，使原本限定地域的虫媒传染病突破国境或自然地理的界限，经由本地病媒生物使病原体扩散，对口岸地区的卫生安全造成极大的威胁。由于不同病媒生物所携带的病原、其危害和发生发展规律均不相同，因而了解口岸病媒生物本底情况，对传染病防控工作科学有效开展十分重要。为摸清温州空港口岸病媒生物种类构成、种群结构和密度变化，及时制定可持续防控计划，防止虫媒传染病在温州口岸发生，本研究于2012至2015年，在温州空港口岸和海港口岸开展了病媒生物本底调查工作。1材料与方法1.1口岸基本情况温州位于我国华东地区浙江的东南部，东经119度37分至121度18分，北纬27度03分至28度36分，东濒东海，海岸线长350km，靠近台湾海峡，南与福建省比邻。温州属于亚热带海洋季风湿润性气候，冬夏季风交替显著，温度适中，四季分明，雨量充沛，年平均气温16.1-18.2℃，年降水量1500-1900mm。七里港码头位于温州市以东的瓯江河口北岸，拥有2.5万吨级多用途泊位、1.5万吨等不同吨级集装箱专用泊位4个，总占地面积405亩，集装箱堆场面积222290000m，拆装箱库面积5000m，煤炭堆场30000m，钢材堆场5000m。码头内有较多的人工绿化（在行政办公区和生活区）。集装箱、散货堆场为水泥硬化地，四周围墙，墙外邻农田。温州龙湾国际机场位于市区东南，距瓯江南侧入海口2km。机场西、南侧为村庄和农田，东北两侧为瓯江入海口，地势平坦。停机坪周围是草坪，外围是农田，行政办公区和生活区有较多的人工绿化，机场跑道和停机坪为硬化地。机场近来来扩建速度加快，T2航站楼及机场办公配套大楼相继施工，使建筑工地增多，周边的农田环境持续发生变化。1.2监测对象鼠类及其体表寄生虫（蚤、蜱、螨）、蚊类、蝇类、蜚蠊。1.3监测范围国境口岸及周边400米环境范围，选取具有代表性的生态环境为监测点，共11 西南大学硕士学位论文设工作区、生活区、绿化带三个监测点。1.4监测时间鼠及其体表寄生虫、蝇类监测时间为5-10月，每月监测1次；蚊类监测时间为每年5-10月，每月上下旬各监测1次；蜚蠊全年每月监测一次。根据气候情况适当调整监测时间。1.5监测方法1.5.1鼠类监测2鼠形动物采用鼠夹法监测，标准2号夹。室内按每15m布2个鼠夹，鼠夹与墙根成垂直布放，并布放于隐蔽处；室外按5到10m布一夹，直线布放，连续布[54]放3天，每次监测有效夹数不少于300夹。诱饵为生花生米。鼠密度=（捕鼠总数/有效夹数）×100%。[55]鼠夹法鼠密度参考控制标准为小于1%。1.5.2蚤类监测蚤类监测调查与鼠类同时进行，将捕获鼠及器械放入白布袋，扎紧袋口，置于带盖塑料桶内。用氯仿或乙醚处理，处理后的鼠体放在白瓷盘上，用梳子或刷子捡蚤，装入75%酒精玻璃试管中（以湿毛笔沾入），并在解剖镜下进行分类计数。鼠体蚤指数=检获蚤数/检查捕获活鼠数。鼠体染蚤率（%）=（带蚤鼠数/集蚤鼠总数）×100%鼠体蚤指数=总蚤数/某种鼠总数蚤构成比（%）=（某种总蚤数/集蚤总数）×100%。1.5.3蜱类监测鼠体寄生蜱类同鼠类调查同时进行，检蜱方法同蚤类。鼠体蜱指数=检获蜱数/检查捕获活鼠数1.5.4螨类监测螨类同鼠类调查同时进行，检螨方法同蚤类。1.5.5成蚊监测成蚊监测采用CO2诱蚊器法，于每年5-10月上下旬各监测1次，布放时间为日落后2h，连续3d。每个监测点放置1台CO2诱蚊器。成蚊参考控制标准为平均密度小于60头/灯*小时。平均密度［头/灯*小时］＝捕蚊总数/布放CO2诱蚊灯总数*3天*2小时*2次1.5.6蝇类调查12 第二章温州口岸病媒生物本底调查蝇类采用诱蝇笼法，时间为每年5-10月，每月监测1次。每个监测点放置1个捕蝇笼，每次监测于9:00布放捕蝇笼，次日同时段收回。诱饵为动物质（鱼下脚料）及植物质（西瓜或苹果）各250g。蝇类参考控制标准为平均密度小于200头/笼*日。平均密度［头/笼*日］=捕获蝇总数/投放诱蝇笼总数1.5.7蜚蠊监测粘蟑板法：每年1-12月，统一使用粘蟑板。使用前内壁紫外线灭菌消毒，使用时在盒内放约2克现配的蜚蠊诱饵（配方：3份炒面粉或新鲜面包屑+1份红糖）。2一般每15m放置2张（较大的场所也可以梅花五点或三角形三点的形式布点），晚放次晨收。平均密度［头/板*夜］=捕获蜚蠊总数/有效粘蟑板总数1.6标本鉴定[56]参考《口岸实用医学媒介生物彩色鉴定图谱》、《上海口岸截获外来媒介[57][58]生物实物图谱》、《中国国境口岸医学媒介生物鉴定图谱》、《中国口岸常[59][60]见医学媒介生物鉴定图谱》、《中国经济昆虫志：蜱螨目蜱总科》对监测中捕获的病媒生物进行分类鉴定，疑难物种交由浙江省国际旅行卫生保健中心、中国检验检疫科学研究院专家进行鉴定。1.7统计分析运用EXCLE软件进行数据整理、绘制密度变化曲线。运用SPSS22.0软件进2行数据的统计分析，率和构成比运用χ检验；蚊、蝇、蜚蠊密度采用单因素方差分析；使用独立样本T检验对口岸之间数据进行分析；使用单样本T检验对口岸与省、市的蚊、蝇、蜚蠊密度进行分析。统计显著水平设为P<0.05。2结果与分析2.1七里港码头结果与分析2.1.1鼠形动物及其体表寄生虫（蜱、蚤、螨）2.1.1.1种群组成2012-2015年间，温州七里港码头病媒生物调查共捕获鼠形动物72只，隶属2科4属6种。其名录如下：啮齿目Rodentia鼠科Muridae鼠属Rattus褐家鼠Rattusnorvegicus(Berkenhout,1769)13 西南大学硕士学位论文黄胸鼠RattustanezumiTemminck,1844黄毛鼠Rattuslosea(Swinhoe,1870)姬鼠属Apodemus黑线姬鼠Apodemusagrarius(Pallas,1771)小家鼠属Mus小家鼠MusmusculusLinnaeus,1758食虫目Insectivora鼩鼱科Soricidae臭鼩属Suncus臭鼩鼱Suncusmurinus(Linnaeus,1766)2.1.1.2密度变化2012-2015年，温州七里港码头布放有效鼠夹13154个，捕获鼠形动物72只，鼠类年平均密度为0.55%；各年平均密度分别为0.78%、1.31%、0.71%和0.46%，最高为2013年。2012-2015年间，月密度高峰分别为7月、6月、6月和9月，其中月密度最高为2013年6月，达3.44%（表2-1，图2-1）。2012-2015年间，鼠2形动物密度变化存在统计学差异（χ=29.567,P<0.05）。4320122013density2014）2%2015密度（101月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月图2-12012-2015年温州七里港口岸鼠类密度变化Fig.2-1SeasonalfluctuationofrodentsinQiligangportfrom2012to201514 第二章温州口岸病媒生物本底调查表2-12012-2015年温州七里港码头鼠类密度情况Table2-1DensityofrodentinQiligangportfrom2012to2015年份项目1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月总计YearItemJanuaryFebruaryMarchAprilMayJuneJulyAugustSeptemberOctoberNovemberDecemberTotal2012捕获数（只）////235451//20有效夹数（夹）////433432433430425417//2570密度（%）////0.460.691.150.931.180.24//0.782013捕获数（只）/////110361//21有效夹数（夹）/////320330315317323//1605密度（%）/////3.440.000.951.890.31//1.312014捕获数（只）////221000016有效夹数（夹）////4414384444414324384414413516密度（%）////0.450.460.230.000.000.000.000.230.172015捕获数（只）10000031842625有效夹数（夹）4654594624594534504534504534534504565463密度（%）0.220.000.000.000.000.000.660.221.770.880.441.320.4615 西南大学硕士学位论文2.1.1.3构成比2012-2015年温州七里港码头捕获的72只鼠形动物中，食虫目54只，占比75.00%；啮齿目18只，占比25.00%。其中，食虫目全部为臭鼩鼱，为绝对优势种。啮齿目黄毛鼠7只，占9.72%；黑线姬鼠5只，占6.94%；黄胸鼠3只，占4.17%；小家鼠2只，占2.78%；褐家鼠1只，占1.39%。温州七里港口岸鼠形动物各年度的构成比见表2-2。不同年度，小家鼠、褐家鼠、黄胸鼠和黑线姬鼠构成比无显著222性差异（小家鼠χ=1.275，P>0.05；褐家鼠χ=1.906，P>0.05；黄胸鼠χ=5.885，2P>0.05；黑线姬鼠χ=2.777，P>0.05）。臭鼩鼱和黄毛鼠在不同年度的构成比具有22显著性差异（臭鼩鼱χ=21.102，P<0.05；黄毛鼠χ=14.577，P<0.05）。表2-22012-2015年温州七里港码头鼠类种群构成比Table2-2ThestructureofrodentsinQiligangportfrom2012to2015各种鼠类种群的构成比（%)捕获总数Theconstituentratioofdifferentrodents年份Totalcapture小家鼠褐家鼠臭鼩鼱黄毛鼠黄胸鼠黑线姬鼠yearnumberMusRattusSuncusRattusRattusApodemusmusculusnorvegicusmurinusloseatanezumiagrarius2012205.000.0085.000.000.0010.002013210.000.00100.000.000.000.00201460.000.0083.330.000.0016.672015254.004.0044.0028.0012.008.00合计Total722.781.3975.009.724.176.942.1.4鼠形动物体表寄生虫（蜱、蚤、螨）监测情况2012-2015年，温州七里港码头监测到鼠形动物体表寄生虫1种3头，属寄螨目Parasiformes、蜱总科Ixodidiae、硬蜱科Ixodidae、硬蜱属Ixodes、粒形硬蜱IxodesgranulatusSupino,1897。未监测到蚤、螨。2.1.2蚊类2.1.2.1种群组成2012-2015年间，温州七里港码头病媒生物调查共捕获蚊类5436头，隶属2科4属6种。其名录如下：双翅目Diptera蚊科Culicidae按蚊亚科Anophelinae16 第二章温州口岸病媒生物本底调查按蚊属GenusAnopheles中华按蚊AnophelessinensisWiedemann,1828库蚊亚科Culicinae库蚊属Culex三带喙库蚊CulextyitaeniorhynchusGiles,1901二带喙库蚊CulexbitaeniorhynchusGiles,1901致倦库蚊CulexpipiensquinquefasciatusSay,1823伊蚊属GenusAedes白纹伊蚊Aedesalbopictus(Skuse,1894)曼蚊属Mansonia常型曼蚊Mansoniauniformis(Theobald,1901)2.1.2.2密度变化2012-2015年，温州七里港码头蚊类各年度平均密度分别为4.04头/(台*小时)、7.93头/(台*小时)、8.37头/(台*小时)、6.15头/(台*小时)，最高为2014年。2012-2015年密度高峰分别为8月和6月，其中月密度最高为2014年6月，达19.47头/(台*小时)（表2-3，图2-2）。使用单因素方差分析（one-wayANOVA）对2012-2015蚊类密度进行分析，发现无显著性差异（P=0.319）。表2-32012-2015年温州七里港码头蚊类密度情况Table2-3DensityofmosquitoinQiligangportfrom2012to2015年份项目5月6月7月8月9月10月合计YearItemMayJuneJulyAugustSeptemberOctoberTotal2012捕获数（头）6614123128513515873密度（头/台*小时）1.833.926.427.923.750.424.042013捕获数（头）/1874014492501401427密度（头/台*小时）/5.1911.1412.476.943.897.932014捕获数（头）152701367317208621807密度（头/台*小时）4.2219.4710.198.815.781.728.372015捕获数（头）291355228272141691329密度（头/台*小时）8.089.866.337.560.394.696.1517 西南大学硕士学位论文20）16number/trap*hour12（2012density82013小时）2014*台2015/4密度（只05月6月7月8月9月10月图2-22012-2015年温州七里港口岸蚊类密度变化Fig.2-2SeasonalfluctuationofmosquitoinQiligangportfrom2012to20152.1.2.3构成比上述蚊类中，库蚊属占比93.84%，其中致倦库蚊3764头，占69.24%，是优势种；三带喙库蚊903头，占16.61%；二带喙库蚊434头，占7.98%；按蚊属占4.54%，仅中华按蚊一种，247头；伊蚊属占1.60%，仅有白纹伊蚊一种，捕获87头；曼蚊属占0.02%，仅有常型曼蚊一种，捕获1头（表2-4）。不同年间致倦库蚊、三带喙库蚊、二带喙库蚊、中华按蚊、白纹伊蚊构成比变化均有显著性差异22（致倦库蚊χ=892.883，P<0.05；三带喙库蚊χ=1215.670，P<0.05；二带喙库蚊222χ=800.586，P<0.05；中华按蚊χ=207.470，P<0.05；白纹伊蚊χ=70.780，P<0.05）。表2-42012-2015年温州七里港码头蚊类种群构成比Table2-4ThestructureofmosquitoinQiligangportfrom2012to2015捕获总各种蚊类种群的构成比（%）数Theconstituentratioofdifferentmosquitos年份Total白纹伊蚊中华按蚊三带喙库蚊二带喙库蚊致倦库蚊常型曼蚊YearcaptureAedesAnophelesCulexCulexCulexpipiensMansonianumberalbopictussinensistyitaeniorhynchusbitaeniorhynchusquinquefasciatusuniformis20128734.581.8316.6131.5045.360.11201314271.2611.219.324.9873.230.00201418070.283.210.724.2191.590.00201513291.810.9846.050.9050.260.00合计54361.604.5416.617.9869.240.0218 第二章温州口岸病媒生物本底调查2.1.3蝇类2.1.3.1种群组成在2012-2015年间，温州七里港码头的病媒生物调查中，共捕获蝇类13355头，隶属4科14属20种，其名录如下：双翅目Diptera花蝇科Anthomyiidae花蝇属Anthomyia横带花蝇AnthomyiaillocataWalker,1859地种蝇属Delia灰地种蝇Deliaplatura(Meigen,1826)海花蝇属Fucellia黑斑海花蝇FucelliaapicatisKertesz,1908中华海花蝇FucelliachinensisKertesz,1908蝇科Muscidae溜蝇属Lispe东方溜蝇LispeorientalisWiedemann,1830家蝇属Musca舍蝇MuscadomesticavicinaMacq.,1850市蝇MuscasorbensWiedemann,1830家蝇MuscadomesticaLinnaeus,1758黑蝇属Ophyra斑跖黑蝇Ophyrachalcogaster(W.d.,1824)厕蝇属Fannia元厕蝇FanniapriscaStein,1918纹蝇属Graphomya绯胫纹蝇GraphomyarufitibiaStein,1918腐蝇属Muscina厩腐蝇MuscinastabulansFallen,1817丽蝇科Calliphoridae阿丽蝇属Aldrichina巨尾阿丽蝇Aldrichinagrahami(Aldrich,1930)绿蝇属Lucilia铜绿蝇Luciliacuprina(Wiedemann,1830)19 西南大学硕士学位论文亮绿蝇Luciliaillustris(Meigen,1826)紫绿蝇Luciliaporphyrina(Walker,1856)丝光绿蝇Luciliasericata(Meigen,1826)金蝇属Chrysomyia大头金蝇Chrysomyiamegacephala(Fabricius,1724)麻蝇科Sarcophagidae黑麻蝇属Helicophagella黑尾黑麻蝇Helicophagellamelanura(Meigen,1826)别麻蝇属Boettcherisca棕尾别麻蝇Boteecheriscaperegrina(Robineau-Desvoidy,1830)2.1.3.2密度变化2012-2015年，温州七里港码头蝇类平均密度为193.55头/笼，各年蝇类平均密度分别为104.00头/笼、253.80头/笼、151.94头/笼、274.50头/笼，2015年最高。2012-2015年密度高峰均为7月，其中月密度最高为2015年7月，达709.33头/笼（表2-5和图2-3）。使用单因素方差分析（one-wayANOVA）对2012-2015蝇类密度进行分析，发现无显著性差异（P=0.273）。表2-52012-2015年温州七里港码头蝇类密度情况Table2-5DensityoffliesinQiligangportfrom2012to2015年份项目5月6月7月8月9月10月合计YearItemMayJuneJulyAugustSeptemberOctoberTotal2012捕获数（头）53187964195823911872密度（头/笼）17.6762.33321.3365.0027.33130.33104.002013捕获数（头）/8421606896246463807密度（头/笼）/280.67535.3329.67208.00215.33253.802014捕获数（头）29345880129639049702735密度（头/笼）97.67152.6726798.67130165.67151.942015捕获数（头）112399212883031511574941密度（头/笼）37.33133.00709.33276.67105.00385.67274.5020 第二章温州口岸病媒生物本底调查800600400density(number/cage)20122013/笼）20020142015密度（只05月6月7月8月9月10月图2-32012-2015年温州七里港口岸蝇类密度变化Fig.2-3SeasonalfluctuationoffliesinQiligangportfrom2012to20152.1.3.3构成比2012-2015年温州七里港码头捕获13355头蝇类，丽蝇科3属6种，占比最高，达80.69%，其中金蝇属1种，为大头金蝇，占比50.85%，为优势种；绿蝇属4种，占比29.55%，分别为铜绿蝇0.46%、紫绿蝇0.24%、亮绿蝇0.07%、丝光绿蝇28.79%；阿丽蝇属1种，为巨尾阿丽蝇，占比0.28%。麻蝇科2属2种，占比8.48%，其中别麻蝇属1种，为棕尾别麻蝇，占比4.70%；黑麻蝇属1种，为黑尾黑麻蝇，占比3.78%。蝇科6属8种，占比7.79%，其中家蝇属3种，占比6.75%，分别为市蝇1.15%、家蝇1.01%、舍蝇4.58%；黑蝇属1种，为斑跖黑蝇，占比0.34%；厕蝇属1种，为元厕蝇，占比0.25%；纹蝇属1种，为绯胫纹蝇，占比0.14%；腐蝇属1种，为厩腐，占比0.20%；溜蝇属1种，为东方溜蝇，占比0.10%。花蝇科3属4种，占比3.03%，其中地种蝇属1种，为灰地种蝇，占比1.10%；海花蝇属2种，占比1.09%，分别为黑斑海花蝇0.13%、中华海花蝇0.95%；花蝇属1种，为横带花蝇，占比0.85%。不同年间，大头金蝇、黑尾黑麻蝇构成比变化无显著性差异（大头金蝇22χ=6.905，P>0.05；黑尾黑麻蝇χ=5.959，P>0.05）；而各年间，丝光绿蝇、棕尾2别麻蝇、横带花蝇、市蝇构成比变化则有显著性差异（丝光绿蝇χ=16.727，P<0.05；222棕尾别麻蝇χ=24.523，P<0.05；横带花蝇χ=26.080,P<0.05；市蝇χ=73.267，P<0.05）（表2-6）。21 西南大学硕士学位论文表2-62012-2015年温州七里港码头蝇类种群构成比Table2-6ThestructureoffliesinQiligangportfrom2012to2015各种蝇类种群的构成比（%）捕获总Theconstituentratioofdifferentflies数年份大头金蝇棕尾别麻蝇Total丝光绿蝇黑尾黑麻蝇横带花蝇市蝇yearChrysomyiaBoteecheris其他captureLuciliaserHelicophageAnthomyiMuscasomegacephalcaOthorsnumbericatallamelanuraaillocatarbensaperegrina2012187252.7231.845.184.221.600.324.112013380750.7529.845.153.700.471.658.432014273548.9627.865.813.070.482.3011.522015494151.2627.343.564.071.050.4512.26合计1335550.8528.794.703.780.851.159.88Total2.2温州龙湾国际机场结果与分析2.2.1鼠形动物及其体表寄生虫（蜱、蚤、螨）2.2.1.1种群组成在2012-2015年间，温州龙湾国际机场的病媒生物调查中共捕获鼠形动物95头，隶属2科4属6种。其名录如下：啮齿目Rodentia鼠科Muridae鼠属Rattus褐家鼠Rattusnorvegicus(Berkenhout,1769)黄胸鼠RattustanezumiTemminck,1844黄毛鼠Rattuslosea(Swinhoe,1870)姬鼠属Apodemus黑线姬鼠Apodemusagrarius(Pallas,1771)小家鼠属Mus小家鼠MusmusculusLinnaeus,1758食虫目Insectivora鼩鼱科Soricidae臭鼩属Suncus臭鼩鼱Suncusmurinus(Linnaeus,1766)22 第二章温州口岸病媒生物本底调查2.2.1.2密度变化2012-2015年，温州龙湾国际机场鼠类年平均密度为1.02%，各年平均密度分别为1.08%、0.91%、1.67%、0.72%，其中2014年最高。2012-2015年月密度高峰分别为7月、6月、6月、8月，其中月密度最高为2014年6月，达2.58%（见表22-7和图2-4）。2012-2015年间鼠形动物密度变化没有统计学差异（χ=11.472,P>0.05）。23 西南大学硕士学位论文表2-72012-2015年温州龙湾国际机场鼠类密度情况Table2-7DensityofrodentinLongwaninternationalairportfrom2012to2015年份项目1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月总计YearItemJanuaryFebruaryMarchAprilMayJuneJulyAugustSeptemberOctoberNovemberDecemberTotal2012捕获数（头）////256421//20有效夹数//////3163053063103153041856（夹）密度（%）////0.63%1.64%1.96%1.29%0.63%0.33%//1.08%2013捕获数（头）////272321//17有效夹数//////3123133063153133121871（夹）密度（%）////0.64%2.24%0.65%0.95%0.64%0.32%//0.91%2014捕获数（头）////6864421031有效夹数////3033103153103063113073121855（夹）密度（%）////1.98%2.58%1.90%1.29%1.31%0.64%0.33%0.00%1.67%2015捕获数（头）41122426012227有效夹数3243213243273093033063123063093083053754（夹）密度（%）1.23%0.31%0.31%0.61%0.65%1.32%0.65%1.92%0.00%0.32%0.65%0.66%0.72%24 第二章温州口岸病媒生物本底调查32.52density）1.5%201220131密度（201420150.501月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月图2-42012-2015年温州龙湾国际机场鼠类密度变化Fig.2-4ThestructureofrodentsinLongwaninternationalairportfrom2012to20152.2.1.3构成比上述鼠形动物中，啮齿目占57.89%，食虫目占42.11%。其中，食虫目全部为臭鼩鼱；啮齿目黄毛鼠24.21%；黄胸鼠13.68%；小家鼠7.37%；褐家鼠7.37%；黑线姬鼠5.26%（表2-8）。各类鼠形动物各年度的构成比变化均无统计学意义（小222家鼠χ=4.374，P>0.05;褐家鼠χ=2.142，P>0.05；黄胸鼠χ=0.128，P>0.05；黑线222姬鼠χ=3.995，P>0.05;臭鼩鼱χ=2.807，P>0.05；黄毛鼠χ=6.066，P>0.05）。2012-2015年，温州龙湾国际机场未监测到鼠形动物体表寄生虫（蜱、蚤、螨）。表2-82012-2015年温州龙港国际机场鼠类种群构成比Table2-8SeasonalfluctuationofrodentsinLongwaninternationalairportfrom2012to2015各种鼠类种群的构成比（%)捕获总数Theconstituentratioofdifferentrodents年份Totalcapture小家鼠褐家鼠臭鼩鼱黄毛鼠黄胸鼠黑线姬鼠yearnumberMusRattusSuncusRattusRattusApodemusmusculusnorvegicusmurinusloseatanezumiagrarius20122015.005.0030.0035.0015.000.0020131711.765.8847.0623.5311.760.002014316.4512.9051.619.6812.906.452015270.003.7037.0433.3314.8111.11合计Total957.377.3742.1124.2113.685.2625 西南大学硕士学位论文2.2.2蚊类2.2.2.1种群组成在2012-2015年温州龙湾国际机场病媒生物调查共捕获蚊类5342头，隶属2科3属5种。其名录如下：双翅目Diptera蚊科Culicidae按蚊亚科Anophelinae按蚊属GenusAnopheles中华按蚊AnophelessinensisWiedemann,1828库蚊亚科Culicinae库蚊属Culex三带喙库蚊CulextyitaeniorhynchusGiles,1901二带喙库蚊CulexbitaeniorhynchusGiles,1901致倦库蚊CulexpipiensquinquefasciatusSay,1823伊蚊属GenusAedes白纹伊蚊Aedesalbopictus(Skuse,1894)2.2.2.2密度变化2012-2015年，温州龙湾国际机场蚊类各年度平均密度分别为6.56头/(台*小时)、7.49头/(台*小时)、7.47头/(台*小时)、3.22头/(台*小时)。2012-2015年间蚊类密度变化无显著性差异（P=0.466）。表2-92012-2015年温州龙湾国际机场蚊类密度情况Table2-9DensityofmosquitoinLongwaninternationalairportfrom2012to2015年份项目5月6月7月8月9月10月合计YearItemMayJuneJulyAugustSeptemOctobeTotalberr2012捕获数（头）150172322493257221416密度（头/台*小时）4.174.788.9413.697.140.616.562013捕获数（头）142665333266171401617密度（头/台*小时）3.9418.479.257.394.751.117.492014捕获数（头）621528127179118411614密度（头/台*小时）17.2514.673.534.973.281.147.472015捕获数（头）18729966426734695密度（头/台*小时）5.198.311.831.171.860.943.2226 第二章温州口岸病媒生物本底调查20）15number/trap*hour（102012density）2013小时2014*5/台2015密度（只05月6月7月8月9月10月图2-52012-2015年温州龙湾国际机场蚊类密度变化Fig.2-5ThestructureofmosquitoinLongwaninternationalairportfrom2012to20152.2.2.3构成比上述蚊类中，库蚊属占比达93.04%，其中致倦库蚊占全部蚊种的74.22%，是优势种；三带喙库蚊13.65%；二带喙库5.17%。按蚊属占5.45%，仅捕获中华按蚊一种；伊蚊属占1.52%，仅有白纹伊蚊一种（表2-10）。不同年间致倦库蚊、三带喙库蚊、二带喙库蚊、中华按蚊、白纹伊蚊构成比均有统计学意义（致倦库蚊222χ=1624.714，P<0.05；三带喙库蚊χ=1005.632，P<0.05；二带喙库蚊χ=237.345，22P<0.05；中华按蚊χ=179.662，P<0.05；白纹伊蚊χ=23.782，P<0.05）。表2-102012-2015年温州龙湾国际机场蚊类种群构成比Table2-10SeasonalfluctuationofrodentsinLongwaninternationalairportfrom2012to2015各种蚊类种群的构成比（%）捕获总数Theconstituentratioofdifferentmosquitos年份Totalcapture白纹伊蚊中华按蚊三带喙库蚊二带喙库蚊致倦库蚊yearnumberAedesAnophelesCulexCulexCulexpipiensalbopictussinensistyitaeniorhynchusbitaeniorhynchusquinquefasciatus201214162.7511.7937.8512.8534.75201312940.776.726.412.6383.46201416141.302.110.431.7394.4220156951.580.439.061.7387.19合计Total50191.615.8013.735.1073.7627 西南大学硕士学位论文2.2.3蝇类2.2.3.1种群组成在2012-2015年间，温州龙湾国际机场的病媒生物调查中共捕获蝇类20423头，隶属4科10属14种，其名录如下：双翅目Diptera花蝇科Anthomyiidae花蝇属Anthomyia横带花蝇AnthomyiaillocataWalker,1859海花蝇属Fucellia黑斑海花蝇FucelliaapicatisKertesz,1908中华海花蝇FucelliachinensisKertesz,1908蝇科Muscidae溜蝇属Lispe东方溜蝇LispeorientalisWiedemann,1830家蝇属Musca舍蝇MuscadomesticavicinaMacq.,1850市蝇MuscasorbensWiedemann,1830黑蝇属Ophyra斑跖黑蝇Ophyrachalcogaster(W.d.,1824)丽蝇科Calliphoridae阿丽蝇属Aldrichina巨尾阿丽蝇Aldrichinagrahami(Aldrich,1930)绿蝇属Lucilia铜绿蝇Luciliacuprina(Wiedemann,1830)亮绿蝇Luciliaillustris(Meigen,1826)丝光绿蝇Luciliasericata(Meigen,1826)金蝇属Chrysomyia大头金蝇Chrysomyiamegacephala(Fabricius,1724)麻蝇科Sarcophagidae黑麻蝇属Helicophagella黑尾黑麻蝇Helicophagellamelanura(Meigen,1826)别麻蝇属Boettcherisca棕尾别麻蝇Boteecheriscaperegrina(Robineau-Desvoidy,1830)2.2.3.2密度变化28 第二章温州口岸病媒生物本底调查2012-2015年，温州龙湾国际机场蝇类平均密度为283.65头/笼，各年蝇类平均密度分别为312.61头/笼、257.00头/笼、276.67头/笼、288.33头/笼，2012年最高。2012-2015年密度高峰均为7月，其中月密度最高为2012年7月，达819.67头/笼（表2-11和图2-6）。使用单因素方差分析（one-wayANOVA）对2012-2015蝇类密度进行分析，发现无显著性差异（P=0.978）。表2-112012-2015年温州龙湾国际机场蝇类密度情况Table2-11DensityoffliesinLongwaninternationalairportfrom2012to2015年份项目5月6月7月8月9月10月合计YearItemMayJuneJulyAugustSeptemberOctoberTotal2012捕获数（头）224596245974633512675627密度（头/笼）74.67198.67819.67248.67111.67422.33312.612013捕获数（头）5788991767646436754626密度（头/笼）192.67299.67589.0021.33214.33225.00257.002014捕获数（头）75790416115593488014980密度（头/笼）252.33301.33537.00186.33116.00267.00276.672015捕获数（头）158476223174032012655190密度（头/笼）52.67158.67743.67246.67106.67421.67288.3390075060020124502013density(number/cage)2014/笼）3002015150密度（只05月6月7月8月9月10月图2-62012-2015年温州龙湾国际机场蝇类密度变化Fig.2-6ThestructureoffliesinLongwaninternationalairportfrom2012to20152.2.3.3构成比29 西南大学硕士学位论文从调查结果看，2012-2015年温州龙湾国际机场捕获的20423头蝇类构成比如下：丽蝇科3属5种，占比最高，达84.40%，其中金蝇属1种，为大头金蝇，占比59.91%，为优势种；绿蝇属3种，占比24.50%，其中铜绿蝇0.06%、亮绿蝇0.15%、丝光绿蝇24.29%；阿丽蝇属1种，为巨尾阿丽蝇，占比0.24%。蝇科3属4种，占比9.54%，其中家蝇属2种，占比7.82%，分别为市蝇0.65%、舍蝇7.17%；溜蝇属1种，为东方溜蝇，占比1.11%；黑蝇属1种，为斑跖黑蝇，占比0.62%。麻蝇科2属2种，占比4.45%，其中黑麻蝇属1种，为黑尾黑麻蝇，占比2.51%；别麻蝇属1种，为棕尾别麻蝇，占比1.94%。花蝇科2属3种，占比1.36%，其中海花蝇属2种，占比1.03%，分别为黑斑海花蝇0.10%、中华海花蝇0.93%；花蝇属1种，为横带花蝇，占比0.33%。不同年间黑尾黑麻蝇构成比变化无统计学意义（黑尾黑麻蝇χ2=11.117，P>0.05）；而各年间大头金蝇、丝光绿蝇、舍蝇、棕尾别麻蝇、东方溜蝇构成比变化则存在统计学意义（大头金蝇χ2=29.873，P<0.05；丝光绿蝇χ2=16.741，P<0.05；舍蝇χ2=30.032，P<0.05；棕尾别麻蝇χ2=114.644，P<0.05；东方溜蝇χ2=130.235，P<0.05）（图2-12）。表2-122012-2015年温州龙湾国际机场蝇类种群构成比Table2-12ThestructureoffliesinLongwaninternationalairportfrom2012to2015各种蝇类种群的构成比（%）捕获总数Theconstituentratioofdifferentflies年份Total舍蝇大头金蝇丝光绿蝇黑尾黑麻蝇棕尾别麻蝇东方溜蝇YearcaptureMusca其他ChrysomyiaLuciliaserHelicophagellaBoteecheriscaLispenumberdomesticaOthorsmegacephalaicatamelanuraperegrinaorientalisvicina2012562761.5623.468.091.990.442.242.222013462658.3226.556.532.752.401.362.102014498061.8523.765.802.431.890.703.572015519057.6723.688.052.933.200.044.43合计Total2042359.9124.297.172.511.941.114.1830 第二章温州口岸病媒生物本底调查2.2.4蜚蠊2.2.4.1种群组成在2012-2015年间，温州龙湾国际机场的病媒生物调查中共捕获蜚蠊9655头，隶属2科2属4种，其名录如下：蜚蠊目Blattodea蜚蠊科Blattidae大蠊属Periplaneta褐斑大蠊PeriplanetabrunneaBurmrister,1838美洲大蠊Periplanetaamericana(Linnaeus,1758)黑胸大蠊PeriplanetafuliginosaServille,1839姬蠊科Blattellidae姬蠊属Blattella德国小蠊Blattellagermanica(Linnaeus,1767)2.2.4.2密度变化2012-2015年，温州龙湾国际机场平均蜚蠊密度为7.97头/张，各年蜚蠊平均密度分别为8.36头/张、8.89头/张、8.83头/张、5.88头/张，2013年最高。2012-2015年密度高峰分别为5月和6月，其中月密度最高为2013年5月，达32.68头/张（表2-13和图2-7）。使用单因素方差分析（one-wayANOVA）对2012-2015年间蜚蠊密度进行分析，发现无显著性差异（P=0.787）。31 西南大学硕士学位论文表2-132012-2015年温州龙湾国际机场蜚蠊密度情况Table2-13DensityofcockroachinLongwaninternationalairportfrom2012to2015年份项目1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月总计YearItemJanuaryFebruarMarchAprilMayJuneJulyAugustSeptembOctoberNovembDecembTotalyererer2012捕获数（头）42112477246713432397159187142772507粘板数（张）252525252525252525252525300密度（头/张）1.680.440.963.089.8428.5217.2815.886.367.485.683.088.362013捕获数（头）382017220581759623713818112480582666粘板数（张）252525252525252525252525300密度（头/张）1.520.806.888.2032.6823.849.485.527.244.963.202.328.892014捕获数（头）26371132096366833173514810760622649粘板数（张）252525252525252525252525300密度（头/张）1.041.484.528.3625.4427.3212.6814.041.924.282.42.488.832015捕获数（头）8483361108199476652164610372201833粘板数（张）262626262626262626262626312密度（头/张）3.233.1913.884.157.6518.312.508.311.773.962.770.775.8832 第二章温州口岸病媒生物本底调查35）3025number/sheet（202012density1520132014/张）1020155密度（只01月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月图2-72012-2015年温州龙湾国际机场蜚蠊密度变化Fig.2-7SeasonalfluctuationofcockroachinLongwaninternationalairportfrom2012to20152.2.4.3构成比从调查结果看，2012-2015年温州龙湾国际机场捕获的9655头蜚蠊中，姬蠊属9364头，占比96.99%，全部为德国小蠊，为优势种；大蠊属占比3.01%，其中黑胸大蠊118头，占1.22%；美洲大蠊97头，占1.00%；褐斑大蠊76头，占0.79%（表2-14）。德国小蠊、黑胸大蠊、美洲大蠊、褐斑大蠊各年度构成比变化均有22统计学意义（德国小蠊χ=21.615，P<0.05；黑胸大蠊χ=109.582，P<0.05；美洲大22蠊χ=27.836，P<0.05；褐斑大蠊χ=14.542，P<0.05）。表2-142012-2015年温州龙湾国际机场蜚蠊种群构成比Table2-14ThestructureofcockroachinLongwaninternationalairportfrom2012to2015各种蚊类种群的构成比（%）捕获总数Theconstituentratioofdifferentmosquitos年份Totalcapture德国小蠊美洲大嬚褐斑大蠊黑胸大蠊yearnumberBlattellaPeriplanetaPeriplanetaPeriplanetagermanicaamericanabrunneafuliginosa2012250796.011.481.081.442013266697.970.901.130.002014264997.401.360.490.762015183396.290.000.333.38合计Total965596.991.000.791.2233 西南大学硕士学位论文3讨论3.1温州七里港码头3.1.1鼠形动物调查结果分析2012-2013年按照有关要求仅对5-10月份的鼠形动物密度进行了调查，但根据温州的气候情况并结合地方疾控中心调查方法，将2014年监测调查时间调整为全年。总体上看，七里港鼠形动物密度变化在不同年度间存在显著性差异，且鼠形动物密度呈下降趋势。但根据国家标准《GB/T病媒生物密度监测方法鼠类》规定，鼠形动物密度应控制在1%以下，而温州七里港口岸2012-2015年间共有6个月份超过国家标准，特别是2013年全年平均密度超过1%，显著高于同期浙江省鼠形[61]动物密度。本调查结果提示口岸应当加强防控措施。从密度变化看，鼠形动物密度变化呈双峰消长型。夏末秋初是鼠形动物活动的高峰时期。前高峰主要集中[62]在9月份，后高峰为12月，这和萧山国际机场的鼠形动物消长规律较为相似。2013年7月密度大幅降低，2014年相较其他年份密度较低，这是由于在2013年7月和2014年8-10月间口岸采取了防控措施导致的。然而，由于鼠形动物繁殖能力和环境适应能力强，如不能持续实施防控，动物密度会在较短时间内恢复到正常。所以，口岸应持续关注其密度动态变化，制定长期的控制方案。从种群变化看，2012-2015年，温州七里港码头捕获鼠形动物2科4属6种，鼠形动物优势种为臭鼩鼱，占总捕获数的75%。臭鼩鼱栖息地广泛，不仅栖于农田、荒地、池塘边的灌木丛、草丛、树林，也可栖于住宅，在泥地、厨房水沟、[63]阴暗潮湿处。七里港码头周边农田丰富、水系较多，给臭鼩鼱生长繁殖提供了有利的生境。2012-2014年，鼠形动物构成无较大变化，以臭鼩鼱和黑线姬鼠为主。但在2015年，鼠形动物种群构成发生明显变化，监测到了之前未发现的黄毛鼠、黄胸鼠、褐家鼠，且以臭鼩鼱和黄毛鼠为主。这可能是由于七里港码头业务基本稳定，近年来未进行扩建，周边农田和农村生境增加，使原本栖息于周边的鼠类扩大了生活范围，转移到了码头范围内。如黄胸鼠和褐家鼠属于家栖为主，且褐[64]家鼠住下层、黄胸鼠住上层，两者同室居住。2015年监测调查中也同时监测到这2个物种，佐证了这一观点。而2015年新监测到的黄毛鼠占2015年数量的28.00%，占全部的9.72%，仅次于臭鼩鼱。黄毛鼠本身喜欢栖息于近水而潮湿的地[65]方，如农田、池塘边、海岸处，表明其适应了七里港码头的生境并快速繁衍，可能对今后的种群构成造成影响。黑线姬鼠除2013年外，均有监测到，占总数量的6.94%，居于第三位，其构成比例较为稳定，可能与其栖息于荒地、树林，不与[58]其他鼠类栖息地冲突有关。2012-2015年，鼠表寄生虫仅发现粒形硬蜱1种，共3头。粒形硬蜱生活于山34 第二章温州口岸病媒生物本底调查地林区、平原草地及田野，是我国南方常见种，主要寄生于小型哺乳动物身上，[66]可自然感染伯氏疏螺旋体，引起莱姆病，而且通过血清学和分子生物学方法证[67]实浙江省有莱姆病发生。有研究显示，粒形硬蜱是温州市鼠形动物体表寄生蜱[68]类的优势种。七里港口岸与温州市监测结果一致，警示口岸存在蜱传传染病的可能。然而，本调查未发现蚤、螨等其他鼠表寄生虫，这可能是由于鼠夹法捕获的鼠形动物大部分已死亡，而蚤对生物的体温变化极其敏感有关，蚤类一旦发现[69]寄主体温下降，就会离开寻找新的寄主。总体而言，温州七里港码头鼠形动物群落在2015年发生了较大变化，形成了新的生物群落，表明其传播疾病的风险会大大增加。一旦虫媒传染病疫情输入或传入，有可能对工作人员和周边居民的健康造成威胁。研究表明，臭鼩鼱可传播[70]鼠疫菌、钩端螺旋体、恙虫病东方体等病原；黄毛鼠、褐家鼠、黄胸鼠可传播[71]鼠疫、Q热、钩端螺旋体病等多种疾病；黑线姬鼠是肾综合出血热主要宿主，也是鼠疫、恙虫病、钩端螺旋体病、图拉弗朗西斯菌病及斑点热的传播媒介，它们均是口岸不可忽视的病媒生物。尽管未发现上述鼠形动物携带的体表寄生虫，但有研究表明鼠密度与鼠疫、流行性出血热、钩端螺旋体病等传染病存在明显相[62]关，口岸应当继续采取综合防制措施，保持其密度维持在较低水平。3.1.2蚊类调查结果分析从密度变化看，2012-2015年，温州七里港码头年份间蚊虫密度没有显著性差异，且均未超过控制标准60头/(台*小时)。与2012、2013年浙江省及温州市蚊类密度相比，七里港码头蚊类密度在2012年没有显著性差异，而在2013年，其密[61;72]度显著高于浙江省和温州市蚊类密度，暗示口岸应当加强防控。蚊类密度变化呈单峰消长型，夏季为蚊类活动的高峰时期，这和全国多数口岸监测的结果具[73;74]有一致性。2012-2015年间，密度高峰分别为8月和6月，高峰期有提前的趋[75]势，可能与气候变化相关。蚊类的活动与温度的变化有密切关系，据气像资料[76]显示，2014、2015年6月气温明显高于2012和2013年，导致蚊类活动高峰提前。而2015年10月蚊类密度不同于以往的上升趋势，也同气候的变暖有密切关系。从种群构成看，各蚊类的构成比例发生了显著变化。2012-2015年间，温州七里港码头捕获蚊类2科4属6种，优势种为致倦库蚊，占全部蚊类的69.24%。年度构成比的分析发现，2012-2014年，致倦库蚊构成比持续增加，最高达到2014年的91.59%，而2015年致倦库蚊虽然仍占比最高，但构成比却有了大幅度的下滑，推测是由于水系变化导致的。研究表明，城市化进程中水系的改变、绿化的改变、[77]水质的改变均对蚊虫孳生产生影响。致倦库蚊是滋生类型为污水型，如粪坑、[78]水坑、水沟、水池、水缸、容器等。而2014年开始，为建设美丽浙江，浙江省35 西南大学硕士学位论文委、省政府将“排涝水、治污水、保供水、防洪水、抓节水”作为全面深化改革[79]的重要内容和需重点突破的改革项目开始实施。至2015年，乐清市七里港码头[80]治水成效得到体现，水质改变明显，破坏了致倦库蚊的滋生环境，导致其种群数量的下降。同致倦库蚊相反，居于种群构成第二位的三带喙库蚊（16.61%）在2012-2014年间比例持续降低，而2015年构成比大幅提升。推测上述改变同样是由于水质变化引起。三带喙库蚊幼虫滋生于城乡清洁或稍污染、静止或流动的温[58]暖水体，常见于向阳泥底、水质清洁、水位较低、漂浮植物丛生的水域。所以，水体质量的好转有利于其种群扩大。另一方面，研究表明，三带喙库蚊是绝大多数地区稻田蚊虫的优势种，七里港周边农田的增多也可能使其种群扩大的原因之一。2012-2015年间，白纹伊蚊在种群结构中的比例呈波浪型变化，这是与其滋生地主要为竹筒、树洞、石穴、废旧轮胎以及缸罐等容器积水，易受到人为干预有[81]关，暗示口岸应当清除容器性积水可以有效防控白纹伊蚊。总之，温州七里港口岸蚊类种群组成稳定、种群构成受到人类活动的干预在近1年有较为明显的变化。密度变化受气温影响有提前趋势，总体的密度水平处于较低位置，未达到国家防控标准。但七里港码头几种蚊类均是重要蚊媒传染病[59;82;83]的传播媒介，其中，致倦库蚊是乙型脑炎、班氏丝虫病的重要传播媒介，也是西尼罗病毒的传播媒介。三带喙库蚊是乙型脑炎的重要传播媒介，能感染基孔肯雅热病毒和马来丝虫，也有国外学者曾分离出登革热病毒。二带喙库蚊是鸟疟原虫传播媒介之一，能感染乙型脑炎病毒、马来丝虫。白纹伊蚊是登革热、乙型脑炎、基孔肯雅热的重要传播媒介，国外有文献报道可人工感染黄热病。中华按蚊是我国疟疾、马来丝虫病的主要传播媒介，也是班氏丝虫病的次要传播媒介。[84][85]尽管温州已消除丝虫病、乙型脑炎病例因疫苗普及少有发现，但登革热、基[86;87]孔肯雅热、疟疾等输入性疫情疫病仍然可以通过输入性途径传入，一旦通过蚊媒传播，可能造成局部暴发。上述结果警示七里港码头当更加注重对来自上述疾病疫区的船舶行李、包裹等的卫生检疫工作，关注蚊类密度的动态变化，以便第一时间介入，防止上述疾病输入。3.1.3蝇类调查结果分析从密度变化看，温州七里港码头蝇类平均密度年度间无显著性差异。2012-2015年间，温州七里港码头共有9个月份蝇类密度超过控制标准，而2013和2015年年均密度均超过控制标准（小于200头/笼）。与浙江省蝇类密度对比，2013年七[61]里港蝇类密度显著高于浙江省蝇类密度（P<0.05）。这提示口岸应当加强蝇类防控，确保其密度处于控制标准之下。2012-2015年间，七里港口岸蝇类密度折线图呈单峰消长型，其活动高峰均集中在7月份，这和北京口岸、大连口岸、肖厝[6;74;88]口岸的调查结果一致。和蚊类相似，2015年10月蝇类密度也存在不同于以36 第二章温州口岸病媒生物本底调查往的上升趋势，这也可能同气温的变暖有密切关系。监测数据表明，夏季是蝇类活动的高峰时期，应当选择6月作为防控时间点，采取有力措施，在其活动高峰前控制蝇类密度，防止肠道传染病流行。从种群结构来看，2012-2015年，七里港口岸捕获蝇类以大头金蝇、丝光绿蝇为主，分别占总数的50.85%和28.79%。调查发现，七里港口岸蝇类种群结构变化不大，表明温州七里港码头的蝇类生态结构较为稳定。七里港口岸蝇类主要种的幼虫均孳生于人粪便或垃圾中，如大头金蝇主要孳生于厕所、粪池等人粪便中，也可孳生于腐败动物质和垃圾中；丝光绿蝇主要孳生于腐败的动物质中，人粪、猪粪、动物饲料和垃圾内也可孳生；黑尾黑麻蝇主要孳生于人粪块、猪粪块、旱[59]厕、腐败动物质中，以人粪为主。这提示口岸防控蝇类应当加强病媒生物滋生地的改造，根据蝇类的生态习性，改变生存条件，如垃圾堆放地及时做好清扫、厨余密封存放等，减少媒介在环境中的容纳量，达到控制其滋生繁殖的目的。同时加强健康教育和防制技术宣传，加强对重点部位、重点人员的不良卫生习惯的干预，最大限度的减少人、媒介、病原体的接触。蝇类是一种对公众健康影响较大的媒介，温州七里港口岸的蝇类常见种有大头金蝇、丝光绿蝇、棕尾别麻蝇、黑尾黑麻蝇、市蝇、横带花蝇（占比90.12%），且均可为宿主携带和传播霍乱弧菌、伤寒杆菌和痢疾杆菌等多种肠道疾病病原体。同时，大头金蝇和丝光绿蝇还可携带乙型肝炎病毒，对口岸公共卫生安全造成影[59]响。根据七里港口岸蝇类的密度、种群结构特点，口岸应当及时采取环境治理、化学治理相结合的手段，控制其密度，保障口岸公共卫生安全。3.2温州龙湾国际机场3.2.1鼠形动物调查结果分析从密度变化看，温州龙湾国际机场鼠形动物密度较高，且无显著性变化。在2012-2015年间，共有12个月份超过国家标准规定，2012和2014年平均密度超过1%，提示温州龙湾国际机场应当高度关注鼠形动物密度，采取综合防治措施控制[61]其密度在标准允许范围。同2012年、2013年浙江省鼠形动物密度相比，未发现显著性差别（P>0.05）。和七里港口岸不同，温州龙湾国际机场鼠型动物密度变化呈单峰型，密度高峰集中在夏季。由于2012-2013年监测数据的不充足，无法确定机场鼠形动物的二次密度高峰是否发生在冬季，需要在今后的研究中验证。但根据2014年12月及2015年1月密度显示，鼠形动物在冬季出现1次小高峰，推测温州龙湾国际机场鼠形动物二次密度高峰晚于温州七里港码头。导致该变化的原因还需要进一步的研究分析。2014年鼠形动物数量大幅提升，年均密度上升了0.76个百分点，高达1.67%，这可能与机场的建设发展和病媒生物控制措施有关。温州37 西南大学硕士学位论文龙湾国际机场2012年、2013年、2014年的入出境航班分别比上年度增长了38%、138%和2.1%；入出境总人数分别比上年度增长了37%、138%和8%，机场各项基建设施、食品加工行业发展迅速，改变了以往生境，使鼠形动物更易生存繁衍。同时，机场防鼠设施逐步老化、控制措施没有同步加强，进一步加剧了上述变化。2015年，龙湾国际机场鼠形动物密度下降了0.95个百分点，为0.72%，得益于龙湾国际机场更新了下水道防鼠设施和及时处理了口岸生活垃圾等防控措施。2012-2015年，龙湾国际机场鼠形动物种群结构没有显著性变化，表明其种群结构稳定。优势种为臭鼩鼱，占比42.11%。其次为黄毛鼠，占比24.21%，这是由于机场机坪周边绿化带、园林景观、农田较多，给臭鼩鼱和黄毛鼠提供了有利的生境。值得一提的是，2012-2014年间臭鼩鼱比例持续升高，而2015年其比例却大幅下降；与此相反，2012-2014年间黄毛鼠持续下降，而2015年比例却大幅上升。这可能是由于黄毛鼠本身喜欢栖息于近水而潮湿的地方，如农田、池塘边、海岸处，而臭鼩鼱栖于住宅，在泥地、厨房水沟、阴暗潮湿处居多。2015年龙湾国际机场更新下水道防鼠设施、及时处理口岸生活垃圾等防控措施较为针对臭鼩鼱生活习性，导致其构成比例下降。同时，随着机场扩建，配套的园林景观、池塘等增多，给黄毛鼠创造了有利的生境。2012-2015年，未发现蚤、蜱、螨等鼠表寄生虫。推测原因同七里港码头。温州龙湾国际机场鼠形动物已经形成了较为稳定的生物群落，其种类多、密度高，较多的月份已超过了口岸病媒生物控制标准，表明传播疾病的风险已经存在，应当引起高度重视。相比于温州七里港码头，龙湾国际机场鼠形动物密度更高，种群结构中较为稳定的种类数目更多，入出境人员更为频繁，一旦虫媒传染病疫情输入，传播风险更高、所造成的健康造威胁更大。鼠形动物不仅是重要的病媒生物，其啃咬的习性也会造成电线、电缆、燃气管道等室内外环境的破坏，对于飞行器安全也可能造成影响。同时，一旦鼠形动物随航空器出境，将会对我国的国际形象造成恶劣影响。所以，温州龙湾国际机场应当采取综合防治措施，有效降低鼠形动物密度，直至符合国家相关标准，以保障口岸公共卫生安全，维护国家形象。3.2.2蚊类调查结果分析从密度变化看，2012-2015年，温州龙湾国际机场蚊类平均密度年份间无显著性变化，均未超过控制标准60头/(台*小时)，和浙江省及温州市2013年蚊类密度[61;72]相比，发现无显著性差异。龙湾国际机场蚊类密度变化呈现单峰型，和温州七里港码头成蚊活动高峰期基本一致。2015年蚊类平均密度较低，分析是由于致倦库蚊数量的大幅下降导致的。2012-2015年，温州龙湾国际机场蚊类种群构成发生了显著性的改变，38 第二章温州口岸病媒生物本底调查2012-2014年致倦库蚊构成比持续增加，最高达到2014年的94.42%，而2015年致倦库蚊虽然仍占比最高，但构成比却有了一定程度的下滑。三带喙库蚊恰好与致倦库蚊相反，2012年构成比高于致倦库蚊，但2012-2014年构成比持续下降，2015构成比例上升。蚊类种群结构的变化规律与温州七里港相似，推测同样是由于水体质量的变化导致。总体来看，温州龙湾国际机场蚊类种群组成稳定，种群构成、密度变化和温州七里港较为相似，总体的密度水平处于较低位置，未达到国家防控标准。但温州龙湾国际机场入出境人员增长速度快、入出境国家连年增加，相较于温州七里港码头疫情疫病防控任务更加艰巨。各地案例警示，机场口岸蚊媒传染病传播风险较高，输入性蚊媒传染病一旦通过蚊媒传播，可能造成本地的二次暴发。机场口岸监测发现的集中蚊类均是重要的病媒生物，尤其是白蚊伊蚊和中华按蚊分别是传播登革热和疟疾的重要媒介。同时，据报道温州2004-2012年累计报告输入性[87]登革热病例11例、疟疾病例322例，提示机场口岸有蚊媒传染病局部暴发的风险。目前温州龙湾国际机场有香港航班1条、台湾航班2条、东南亚国家3条，而近年来东南亚、香港、台湾等地由伊蚊传播的登革热疫情严峻，给机场防蚊工作带来挑战。根据调查显示，蚊类的种群构成受到生境的影响较大，人工对其生境的干预有较为明显的作用。这提示口岸应当加强生境改造，如通过清理竹筒、树洞、石穴、废旧轮胎以及缸罐等容器积水消除伊蚊滋生地；通过改变水质减少致倦库蚊、中华按蚊的孳生。3.2.3蝇类调查结果分析从密度变化看，温州龙湾国际机场蝇类平均密度各年份间无显著性变化。密度变化呈单峰消长型，每年的7月为蝇类活动的高峰时期，同七里港口岸一致。结果显示，温州龙湾国际机场2012-2015年间蝇类密度共有14个月份超过200头/笼，大大超过了控制标准，2012和2013年，密度也分别显著高于同期浙江省蝇类[61]密度，这提示口岸应当加强蝇类防控，确保其密度处于控制标准之下。从种群结构来看，在2012-2015年间，龙湾国际机场种蝇类种类和南方地区优[89]势种类一致，种群构成以大头金蝇、丝光绿蝇为主。2012-2015年间各类蝇种的构成比例均发生了显著性变化。主要蝇种除东方溜蝇外，幼虫均孳生于人粪便或垃圾中。东方溜蝇长居于地表积水边，这可能与机场绿化带多，浇灌产生的积水[58]较多有关。总而言之，温州机场口岸蝇类密度大，监测结果警示口岸首先应控制蝇类密度，建议采取化学防治措施，在短时间内降低种群数量。温州龙湾国际机场主要蝇种如大头金蝇、丝光绿蝇、舍蝇、黑尾黑麻蝇、棕尾别麻蝇均是重要的病媒生[90;91]物，可携带和传播乙型肝炎病毒、霍乱弧菌、伤寒杆菌和痢疾杆菌等病原体。39 西南大学硕士学位论文[92]有研究表明，温州市蝇类密度与肠道传染病密切相关。随着近年来空港口岸的扩大开放，入出境人员、货物的大幅提升，蝇类对公共卫生的威胁也随之加大。2014年，温州空港口岸曾发生食物中毒事件，提示口岸应当更加关注可传播肠道疾病的卫生害虫，应在夏季蝇类活动高峰前，控制蝇类密度，防止暴发突发公共卫生事件。3.2.4蜚蠊调查结果分析2012-2015年，蜚蠊平均密度为7.97头/张，各年间无显著性差异。但2012-2013[61]年温州机场蜚蠊密度显著高于同期浙江省水平。蜚蠊全年均有活动，高峰以5月和6月为主，密度变化呈单峰消长型，以德国小蠊为优势种。国小蠊繁殖快、分布广、适应能力强，喜欢在温暖潮湿处栖息，群居，为交通工具、宾馆、饭店[6;88]的优势种，这也和其他口岸的监测结果一致。监测结果表明机场蜚蠊已形成了稳定的种群构成，具备了客观传病的条件。德国小蠊、黑胸大蠊、褐斑大蠊、美洲大蠊均能机械携带痢疾杆菌、大肠杆菌等肠道传染病病原体、病毒、霉菌和蛔[58]虫卵，可在食物和餐具及日常用具上爬行时传播。而且其分泌物和粪便中还含[93]有多种致癌物质和一种特殊恶臭的油状物，可引起人类的不良反应。由于蜚蠊的适应能力、繁殖能力、抗药能力、传病能力都非常强，对人类的健康与安全造成很大的影响，因此温州龙湾国际机场应当持续监测蜚蠊的动态变化，适时开展防治工作。40 第三章温州口岸输入性病媒生物的监测调查第三章温州口岸输入性病媒生物的监测调查病媒生物是传染病在国际间传播的重要载体。病媒生物及其携带的病原体可借助交通工具、集装箱、邮包等载体在国际口岸间传播，使原本限定地域的的虫媒传染病突破国境或自然地理的界限，对口岸地区的卫生安全造成极大的威胁。同时，输入的病媒生物可能会在当地定殖，对当地生态和卫生造成影响。历史上曾发生多次因病媒生物传播导致本地发生输入性传染病暴发的事件，所以，国际[94]上历来重视口岸输入性病媒生物的防控。温州是浙南地区的国际海港、国际空港、贸易中转港，近年来入出境航舶发展迅速，入出境集装箱稳步上升，这使得各类病媒生物传入我国的风险不断增加。同时，南美寨卡病毒、东南亚登革热、安哥拉黄热病、尼日利亚拉沙热、叙利亚利什曼病等多种虫媒传染病频繁发生并广泛传播，更突显输入性病媒生物防控的必要性。为摸清温州口岸输入性病媒生物情况，为口岸和地方卫生部门对病媒生物及虫媒传染病防治工作提供参考依据，防止虫媒传染病在温州口岸发生，本研究于2012至2014年，在温州口岸开展了输入性病媒生物调查工作。1材料与方法1.1监测对象温州口岸入出境集装箱及货物、船舶、航空器、邮包等。1.2监测种类及侵害阳性指征1.2.1监测种类输入性鼠、蚊、蝇、蜚蠊、蚤、蜱、螨、蠓等。1.2.2侵害阳性指征鼠的阳性指征包括活鼠、死鼠、鼠洞、鼠粪、鼠咬痕、鼠爪痕、鼠道、鼠巢、鼠尾痕、鼠叫声等；蚊、蝇的侵害阳性指征包括活的成虫、蛹、幼虫；蜚蠊侵害阳性指征包括活的蜚蠊成虫、若虫及活卵鞘和空卵鞘壳、蟑尸、蟑螂粪便及粪迹等蟑迹；其它种类病媒生物阳性指征包括活的其他种类输入性病媒生物的成虫、蛹、幼虫、若虫和卵等。1.3监测时间常年开展。41 西南大学硕士学位论文1.4监测方法1.4.1国际航行船舶输入性病媒生物的监测主要按照SN/T4271.1~4-2015国际航行船舶携带输入性病媒生物采集方法（蚊类、蝇类、鼠类、蜚蠊）所述方法监测。鼠类及蜚蠊侵害的调查，以入出境船舶在锚地停泊或在码头靠泊期间进行；蚊类和蝇类等双翅目病媒生物的侵害调查，以入境船舶在白天锚地停泊期间进行，锚位距陆地距离不少于1000m，或在船舶靠泊后1h内进行调查。鼠形动物监测采用鼠迹法，在船期允许时等特殊情况下可采用鼠笼法、鼠夹法、粘鼠板法或粉迹法进行船舶鼠类侵害调查。蚊类监测：持电动吸蚊器重点检查生活区外和货舱口外壁阴凉避风的场所墙壁下部1m部位及积水场所和容器蚊类侵害情况。蝇类监测：持捕虫网重点检查船舶生活区外后甲板的垃圾容器周围、缆绳堆、栏杆、生活区周围、货舱周围、上甲板和生活区内厨房（包括垃圾容器）、餐厅、驾驶室、底层生活区走廊等场所蝇类侵害情况。蜚蠊：检疫人员手持强光手电筒，按一定顺序检查船舶生活区，重点检查生活区内厨房、餐厅、垃圾桶周围、食物储藏室、船员休息室、厕所等场所的蜚蠊侵害情况。对船期允许的船舶用粘捕法或蟑螂诱捕盒进行诱捕。其他输入性病媒生物侵害调查：在调查输入性鼠类、蚊类、蝇类和蜚蠊的同时，采用适宜方法对其他输入性病媒生物种类进行采集调查。1.4.2入境集装箱输入性病媒生物的监测在开箱采集之前，核对箱号，检查箱体有无破损、泄露；检查箱口密封橡皮鼠咬痕，通气孔中活体病媒生物昆虫。做好充分的防逃逸措施，在箱门外罩上防逃逸网、在箱门口设置防鼠板等。蝇、蚊、蠓监测：对成虫采用电动吸蚊器法；遇有失去飞行能力或死亡的成虫、幼虫或虫卵，直接用镊子进行捡取；若是集装箱或其装载的货物有积水，可在积水中发现蚊蠓的幼虫，用吸管将幼虫吸取后，移入洁净的容器中。鼠类监测采用鼠笼法、直接捡取法。蜚蠊监测采用诱捕法和直接捡取法。蜱、螨类监测采用动物体表捡取法。1.5标本鉴定鉴定方法同第二章。42 第三章温州口岸输入性病媒生物的监测调查2结果与分析2.1入境集装箱卫生检疫情况2012-2015年，温州口岸共报检351558标箱，查验11471标箱，查验比例3.26%，共检出携带病媒生物集装箱646标箱，检出率5.63%，截获输入性病媒生物823头，隶属4目10科19属31种（表3-1）。表3-12012-2015年，温州口岸入境集装箱卫生检疫基本情况Table3-1SummaryofquarantineforexoticcontainerinWenzhouportfrom2012to2015病媒生物种病媒生物数报检数（标查验数（标查验率(%)疫情检出类（种）（头）年份检出率(%)箱）箱）Quarantine数（标箱）SpeciesofNumberofYearPositiverateDeclarationQuarantineratePositivemedicalmedicalvectorvector20126052442407.01461.08119620138306631653.811454.582123420148102832363.992367.291429120151269408300.6521926.397202合计351558114713.266465.6331823名录如下：啮齿目Rodentia鼠科Muridae鼠属Rattus黄胸鼠RattustanezumiTemminck,1844双翅目Diptera蚊科Culicidae库蚊亚科Culicinae库蚊属Culex二带喙库蚊CulexbitaeniorhynchusGiles,1901致倦库蚊CulexpipiensquinquefasciatusSay,1823伊蚊属GenusAedes白纹伊蚊Aedesalbopictus(Skuse,1894)花蝇科Anthomyiidae地种蝇属Delia43 西南大学硕士学位论文灰地种蝇Deliaplatura(Meigen,1826)海花蝇属Fucellia黑斑海花蝇FucelliaapicatisKertesz,1908蝇科Muscidae家蝇属Musca舍蝇MuscadomesticavicinaMacq.,1850市蝇MuscasorbensWiedemann,1830家蝇MuscadomesticaLinnaeus，1758黑蝇属Ophyra斑跖黑蝇Ophyrachalcogaster(W.d.,1824)厚环黑蝇OphyraspinigeraStein,1910古铜黑蝇Ophyraaenescens(Wiedemann,1830)厕蝇属Fannia元厕蝇FanniapriscaStein,1918纹蝇属Graphomya绯胫纹蝇GraphomyarufitibiaStein,1918腐蝇属Muscina厩腐蝇MuscinastabulansFallen,1817丽蝇科Calliphoridae绿蝇属Lucilia铜绿蝇Luciliacuprina(Wiedemann,1830)亮绿蝇Luciliaillustris(Meigen,1826)巴浦绿蝇Luciliapapuensis(Macquart,1842)丝光绿蝇Luciliasericata(Meigen,1826)金蝇属Chrysomyia大头金蝇Chrysomyiamegacephala(Fabricius,1724)麻蝇科Sarcophagidae黑麻蝇属Helicophagella黑尾黑麻蝇Helicophagellamelanura(Meigen,1826)别麻蝇属Boettcherisca棕尾别麻蝇Boteecheriscaperegrina(Robineau-Desvoidy,1830)酪蝇科Piophilidae酪蝇属Piophila凯氏酪蝇Piophilacasei(Linnaeus,1758)44 第三章温州口岸输入性病媒生物的监测调查蜚蠊目Blattodea蜚蠊科Blattidae大蠊属Periplaneta褐斑大蠊PeriplanetabrunneaBurmrister,1838美洲大蠊Periplanetaamericana(Linnaeus,1758)黑胸大蠊Periplanetafuliginosa(Serville,1839)姬蠊科Blattellidae姬蠊属Blattella德国小蠊Blattellagermanica(Linnaeus,1767)寄螨目Parasiformes蜱总科Ixodidiae硬蜱科Ixodidae花蜱属Amblyomma彩饰花蜱Amblyommavariegatum(Fabricius,1794)丽表花蜱Amblyommalepidum(Dönitz,1808)蓬勃花蜱AmblyommapomposumDönitz,1909璃眼蜱属Hyalomma图兰璃眼蜱HyalommaturanicumPomerantsev,1946表3-22012-2015年温州口岸入境集装箱截获病媒生物情况Table3-2SummaryofinterceptedmedicalvectorsinexoticcontaineratWenzhouportfrom2012to2015鼠类蚊类蝇类蜚蠊蜱RodentsMosquitosFliesCockroachesTicks年份数量构成比数量构成比数量构成比数量构成比数量构成比Year（头）（%）（头）（%）（头）（%）（头）（%）（头）（%）NumbConstituNumbConstituNumbConstituNumbConstituNumbConstituerentratioerentratioerentratioerentratioerentratio201222.0822.086365.632526.0444.17201310.4310.4313658.123414.536226.50201400.0000.0026490.72113.78165.50201500.0010.5019697.0300.0052.48合计30.3640.4965980.07708.518710.5745 西南大学硕士学位论文入境集装箱截获的病媒生物以蝇类为主，共截获659头，占4年截获总量的80.07%；其次为蜱，共截获87头，占比10.57%；截获蜚蠊70头，占比8.51%；蚊类和鼠类占比较少，分别截获4头和3头、占比0.49%和0.36%（表3-2）。其中，蝇类主要以斑跖黑蝇为主，占蝇类的81.03%；蜚蠊以德国小蠊为主，占蜚蠊的65.71%；蜱以彩饰花蜱为主，占蜱的87.36%（表3-3）。表3-32012-2015年温州口岸入境集装箱截获病媒生物主要种类Table3-3MajorspeciesofinterceptedmedicalvectorsinexoticcontaineratWenzhouportfrom2012to2015斑跖黑蝇德国小蠊彩饰花蜱OphyrachalcogasterBlattellagermanicaAmblyommavariegatum年份占比（%）占比（%）占比（%）Year数量（头）数量（头）数量（头）ConstituentConstituentConstituentNumberNumberNumberratioratioratio20125355.211313.5444.1720137331.202510.686226.50201422376.6382.75103.44201518591.5800.0000.00合计53464.88465.59769.2390%）75%60%number/TEU（45%density201230%/标箱）2013201415%2015密度（只0%1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月图3-12012-2015年温州口岸入境集装箱每月截获病媒生物密度变化Fig.3-1Seasonalfluctuationofinterceptedmedicalvectorsinexoticcontainerfrom2012to201546 第三章温州口岸输入性病媒生物的监测调查2.2入境集装箱截获病媒生物的来源2012-2015年，温州口岸入境集装箱截获的病媒生物来源地分布情况见表3-4。截获的病媒生物分布于35个国家和地区，其中占比最高的5个国际和地区依次为：宁波内支线，193头，占比23.45%；南非，151头，占比18.35%；美国，115头，占比13.97%；乌拉圭，82头，占比9.96%；澳大利亚，46头，占比5.59%。其他国家占比均小于5%。2.3入境集装箱截获病媒生物的密度变化按月份统计了2012-2015年入境集装箱截获的病媒生物数量、查验箱数的情况，并对两者的比例，也即截获密度进行了分析（图3-1和表3-5）。2012-2015年，入境集装箱截获媒介的平均密度为7.20%，各年度密度分别为2.26%、7.39%、8.99%、24.70%。各年密度高峰集中在6-10月。47 西南大学硕士学位论文表3-42012-2015年温州口岸入境集装箱截获病媒生物来源地分布情况Table3-4ThesourceofexoticcontainerwhichinterceptedmedicalvectorsatWenzhouportfrom2012to2015国家和地区构成比（%）年份携带数目（头）主要种类主要货物CountryorConstituentYearNumberMajorspeciesMajorcargoregionsratio2012年宁波内支线3839.58德国小蠊空箱南非1616.67斑跖黑蝇盐湿牛皮乌拉圭1313.54斑跖黑蝇空箱美国77.29斑跖黑蝇盐湿牛皮柬埔寨55.21致倦库蚊、德国小蠊盐湿牛皮中国台湾55.21斑跖黑蝇皮革助剂印度尼西亚11.04黄胸鼠皮革助剂其他国家1111.46斑跖黑蝇皮革助剂、牛皮2013年宁波内支线8435.90德国小蠊空箱南非6929.49厚环黑蝇、彩饰花蜱盐湿牛皮中国香港229.40舍蝇空箱美国198.12斑跖黑蝇盐湿牛皮委内瑞拉20.85厚环黑蝇蓝湿牛皮澳大利亚10.43厚环黑蝇盐湿牛皮其他国家3715.81蝇类空箱、皮革助剂、牛皮2014年内支线7124.40巴浦绿蝇、其他蝇类空箱美国6421.99古铜黑蝇、斑跖黑蝇盐湿牛皮南非4515.46斑跖黑蝇、蜱盐湿牛皮乌拉圭3913.40凯氏酪蝇、斑跖黑蝇盐湿牛皮巴西186.19斑跖黑蝇盐湿牛皮意大利175.84斑跖黑蝇盐湿牛皮阿根廷51.72德国小蠊、凯氏酪蝇坚木栲胶其他国家3211.00斑跖黑蝇盐湿牛皮2015年澳大利亚3416.83斑跖黑蝇盐湿牛皮美国2512.38斑跖黑蝇盐湿牛皮乌拉圭2311.39斑跖黑蝇盐湿牛皮南非2110.40丽表花蜱、斑跖黑蝇盐湿牛皮意大利146.93斑跖黑蝇盐湿牛皮泰国136.44斑跖黑蝇盐湿牛皮阿根廷115.45斑跖黑蝇盐湿牛皮香港20.99白纹伊蚊铜板其他国家5929.21斑跖黑蝇盐湿牛皮48 第三章温州口岸输入性病媒生物的监测调查表3-52012-2015年，温州口岸入境集装箱每月截获病媒生物密度情况Table3-5Thedensityofinterceptedmedicalvectorsinexoticcontainerfrom2012to2015年份项目1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月总计YearItemJanuarFebruaMarchAprilMayJuneJulyAugustSepteOctobeNovemDecemTotalyrymberrberber2012捕获数（头）0001010982121513896查验数（标箱）3073144654354473434062893452492493914240密度（头/标箱）0.000.000.002.302.242.621.977.270.586.025.222.052.262013捕获数（头）006137235134331579234查验数（标箱）327812162321531353082473952593244883165密度（头/标箱）0.000.002.785.604.5817.0416.5613.778.350.3917.591.847.392014捕获数（头）2426191070464824151512291查验数（标箱）3301524552452743322892293362481981483236密度（头/标箱）0.612.635.717.763.6521.0815.9220.967.146.057.588.118.992015捕获数（头）2010337247101313101543205查验数（标箱）198915712751181916171214678830密度（头/标箱）10.1010.995.2629.1347.0638.8952.6381.2576.4783.3310.2755.1324.7049 西南大学硕士学位论文2.4入境船舶卫生检疫情况2012-2015年，温州口岸共报检674艘，查验674艘，查验比例100.00%，共检出携带病媒生物船舶34艘，检出率5.04%，截获输入性病媒生物80头，隶属2目6科10属14种（表3-6）。表3-62012-2015年，温州口岸入境船舶卫生检疫基本情况Table3-6SummaryofquarantineforentershipinWenzhouportfrom2012to2015病媒生物种病媒生物数查验率(%)疫情检出类（种）（头）年份报检数（艘）查验数（艘）检出率(%)Quarantine数（艘）SpeciesofNumberofYearDeclarationQuarantinePositiverateratePositivemedicalmedicalvectorvector2012127127100107.873112013143143100128.39629201420420410094.411037201520020010031.5023合计674674100345.041480名录如下：双翅目Diptera花蝇科Anthomyiidae地种蝇属Delia灰地种蝇Deliaplatura(Meigen,1826)蝇科Muscidae家蝇属Musca舍蝇MuscadomesticavicinaMacq.,1850市蝇MuscasorbensWiedemann,1830家蝇MuscadomesticaLinnaeus,1758黑蝇属Ophyra斑跖黑蝇Ophyrachalcogaster(W.d.,1824)厚环黑蝇OphyraspinigeraStein,1910厕蝇属Fannia元厕蝇FanniapriscaStein,1918翠蝇属Neomyia50 第三章温州口岸输入性病媒生物的监测调查蓝翠蝇Neomyiatimorensis(Robineau-Desvoidy,1830)丽蝇科Calliphoridae绿蝇属Lucilia铜绿蝇Luciliacuprina(Wiedemann,1830)丝光绿蝇Luciliasericata(Meigen,1826)金蝇属Chrysomyia大头金蝇Chrysomyiamegacephala(Fabricius,1724)酪蝇科Piophilidae酪蝇属Piophila凯氏酪蝇Piophilacasei(Linnaeus,1758)蜚蠊目Blattodea蜚蠊科Blattidae大蠊属Periplaneta美洲大蠊Periplanetaamericana(Linnaeus,1758)姬蠊科Blattellidae姬蠊属Blattella德国小蠊Blattellagermanica(Linnaeus,1767)表3-72012-2015年，温州口岸入境船舶截获病媒生物情况Table3-7SummaryofinterceptedmedicalvectorsinentershipinWenzhouportfrom2012to2015鼠类蚊类蝇类蜚蠊RodentsMosquitosFliesCockroaches年份构成比构成比构成比构成比数量数量数量数量Year（%）（%）（%）（%）（头）（头）（头）（头）ConstituenConstituenConstituenConstituenNumberNumberNumberNumbertratiotratiotratiotratio201200.0000.00327.27872.73201300.0000.001344.831655.17201400.0000.002362.161437.84201500.0000.003100.0000.00合计00.0000.004252.503847.5051 西南大学硕士学位论文入境船舶截获的病媒生物为蝇类和蜚蠊，其中截获蝇类42头，占4年截获总量的52.50%；其次为蜚蠊，共截获38头，占比47.5%；未见鼠类蚊类及其他病媒生物（表3-7）。其中，蝇类主要以舍蝇为主，占蝇类的54.76%；蜚蠊以德国小蠊为主，占蜚蠊的94.73%（表3-8）。表3-82012-2015年，温州口岸入境集装箱截获病媒生物主要种类Table3-8MajorspeciesofinterceptedmedicalvectorsinentershipatWenzhouportfrom2012to2015舍蝇德国小蠊年份MuscadomesticaBlattellagermanicaYear数量（头）占比（%）数量（头）占比（%）NumberConstituentratioNumberConstituentratio20125355.211313.5420137331.202510.68201422376.6382.75201518591.5800.00合计53464.88465.592.5入境船舶截获病媒生物来源地分布2012-2015年，温州口岸入境船舶截获的病媒生物来源地分布情况见表3-9。截获的病媒生物分布于10个国家和地区，其中前三位分别为中国台湾23.75%；中国香港18.75%；日本13.75%。发现疫情的船舶港籍为中国、中国香港和巴拿马，其中中国、中国香港港籍占77.50%，巴拿马港籍的船舶18艘，占22.50%。90%75%60%45%density(number/ship)2012/艘）201330%20142015密度（只15%0%1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月图3-22012-2015年温州口岸入境船舶每月截获病媒生物密度变化Fig.3-2Seasonalfluctuationofinterceptedmedicalvectorsinentershipfrom2012to201552 第三章温州口岸输入性病媒生物的监测调查表3-92012-2015年，温州口岸入境船舶截获病媒生物来源地分布情况Table3-9ThesourceofentershipwhichinterceptedmedicalvectorsinWenzhouportfrom2012to2015国家和地区年份携带数目（头）主要种类船港籍CountryorYearNumberMajorspeciesFlagregions2012宁波内支线7德国小蠊中国中国香港4舍蝇、德国小蠊中国香港2013中国香港9德国小蠊中国香港中国台湾9舍蝇、丝光绿蝇中国、中国香港澳大利亚5蝇类中国加拿大4德国小蠊巴拿马印度尼西亚1市蝇巴拿马委内瑞拉1厚环黑蝇巴拿马2014年日本11德国小蠊、家蝇中国、中国香港台湾10蝇类、德国小蠊中国香港南非6蓝翠蝇、其他蝇类巴拿马印度尼西亚5家蝇、美洲大蠊巴拿马乌拉圭2凯氏酪蝇巴拿马中国香港2家蝇中国香港澳大利亚1家蝇中国2015年新加坡3蝇类中国2.6入境船舶截获病媒生物密度变化按月份统计了2012-2015年入境船舶截获的病媒生物数量、查验船数的情况，并对两者的比例，也即截获密度进行了分析（图3-2和表3-10）。2012-2015年入境船舶截获媒介的平均密度为11.87%。各年度密度变化呈现双峰型，主要集中在5-6月和9-10月。53 西南大学硕士学位论文表3-102012-2015年，温州口岸入境船舶每月截获病媒生物密度情况Table3-10Thedensityofinterceptedmedicalvectorsinenter-shipfrom2012to2015年份项目1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月总计YearItemJanuarFebruaMarchAprilMayJuneJulyAugustSepteOctobeNovemDecemTotalyrymberrberber2012捕获数（头）9717141288612101113127查验数（标箱）22.220.000.000.000.0037.500.000.0033.3320.000.000.008.66密度（头/标箱）0.000.000.002.302.242.621.977.270.586.025.222.052.262013捕获数（头）00009203601829查验数（标箱）11104811958991148143密度（头/标箱）0.000.000.000.0081.8222.220.0037.5066.670.009.0916.6720.282014捕获数（头）090113031253037查验数（标箱）291515181913141714141917204密度（头/标箱）0.0060.000.005.5668.420.0021.435.8814.2935.7115.790.0018.142015捕获数（头）0000300000003查验数（标箱）22916191820171816141516200密度（头/标箱）0.000.000.000.0016.670.000.000.000.000.000.000.001.5054 第三章温州口岸输入性病媒生物的监测调查2.7入境航空器及国际邮包媒介截获情况2012-2015年在入境航空器及国际邮包未截获输入性病媒生物。3讨论3.1入境集装箱截获病媒生物随着温州对外经济的快速发展，2012-2015年温州口岸入境集装箱数量快速增长。同时，为响应国家简政放权、快速通关的号召，集装箱查验数量、比例连年下降。但温州口岸截获的病媒生物密度、检出率均大幅提升，表明温州口岸由国际集装箱、货物被动携带的输入性病媒生物造成传染病在本地传播流行的风险急剧增加。另一方面，病媒生物突破自然地理限制后极有可能在温州定殖，多样性的生态环境更易受到入侵种的侵害，温州口岸受到外来病媒生物的威胁越来越大。从截获的病媒生物种群构成来看，入境集装箱截获的病媒生物以蝇类为主，占4年截获总量的80.07%；其次为蜱，共截获87头，占比10.57%。其中占蝇类的81.03%的斑跖黑蝇和蜱两类病媒生物主要是从盐湿牛皮中截获的。斑跖黑蝇幼虫滋生于禽畜粪便和垃圾中，在腐败的动物质中也可发现。而盐湿牛皮是由屠宰后新鲜的牛皮用盐渍法腌制后晾晒而成的牛皮。盐湿牛皮未经深加工，还保留着原始的皮毛和脂肪，抗腐败的能力较差，温度较高时会产生腐烂，特别吸引喜腐败动物质的蝇类孳生。蜱主要种为彩饰花蜱，占蜱的87.36%。彩饰花蜱主要分布在非洲部分国家及加勒比海地区，它是引起家畜心水病的一种微生物的主要媒介[95]。蜱极其喜欢皮毛丛密的动物，尤其喜欢牛，经常可以在牛的脖子下方、四腿内侧发现并且非常不容易剔除。由于牛皮未经深加工，牛身上携带的蜱也较为完整的保留了下来。这是导致截获蝇类和蜱数量较多的直接原因。蜚蠊主要集中于内支线携带的空箱中。这是由于内支线船均为中国船，卫生意识、管理水平、人员素质相较于发达国家仍有一定差距，船舶卫生情况较差导致蜚蠊滋生较多。蚊类和鼠类截获较少，但其风险仍然很高。鼠形动物可携带超过200余种病原体，其可能传播的鼠疫为检疫传染病之首；而疫区蚊类输入，极有可能造成蚊媒传染病的本地暴发，如2015年截获的2头白纹伊蚊来自登革热疫区香港。2012-2015年间，共发现9种非本地种的输入性病媒生物，分别为绯胫纹蝇、厚环黑蝇、巴浦绿蝇、古铜黑蝇、凯氏酪蝇、蓬勃花蜱、图兰璃眼蜱、丽表花蜱和彩饰花蜱。其中蜱类全部来自南非；蓝翠蝇来自南非；凯氏酪蝇来自乌拉圭和阿根廷；古铜黑蝇来自美国；厚环黑蝇来自南非、委内瑞拉、澳大利亚；巴浦绿蝇来自内支线。有文献表明，古铜黑蝇在上海和天津有发现，在其他亚州国家均无发现，可能为[89]外来定殖种，这提示口岸存在输入性病媒生物定制扩散的风险。55 西南大学硕士学位论文从来源来看，以宁波内支线、南非、美国、乌拉圭和澳大利亚为来源的集装箱截获的数量较多。宁波内支线的主要货物为空箱、其他国家主要货物均为盐湿牛皮。这提示口岸应当重点关注南非、美国、乌拉圭和澳大利亚入境的集装箱，货物重点关注盐湿牛皮，一旦发现疫情，立即实施彻底的卫生处理。从密度变化看，每年的6-8月截获密度较高，这可能与集装箱内温度较高，给病媒生物孳生提供了有利条件有关。2015年病媒生物截获密度在查验比例大幅下降的基础上大幅提升，提示口岸输入性病媒生物传播疫情疫病、定殖本地的风险大大增加，口岸应当密切关注这项变化，及时收集国际疫情信息，尤其在6-8月要做好防控和卫生处理工作，防止疫情疫病随病媒生物传入。3.2入境船舶截获病媒生物2012-2015年入境船舶截获的病媒生物为蝇类和蜚蠊，占比相当。蝇类主要以舍蝇为主，占蝇类的54.76%；蜚蠊以德国小蠊为主，占蜚蠊的94.73%，二者均可携带肠道传染病病原体，提示国际航行船舶发生肠道性疾病的风险较大。共发现3种非本地种的输入性病媒生物，为蓝翠蝇、厚环黑蝇和凯氏酪蝇，均为蝇类。蝇[58;96]类有翅可飞行，扩散能力较强。本次截获的3种外来蝇种均孳生于人粪，和码头本地主要蝇种的孳生条件相似，表明上述输入性病媒生物存在本地定殖的可能。其中，凯氏酪蝇可能引起蝇蛆症，导致受侵害者机能失调、皮肤受损，严重[97]者可以致命。从来源看，来自中国台湾、中国香港和日本的船舶携带的病媒生物最多。进一步分析发现，77.50%的媒介均来源于船籍为中国、中国香港的船舶。这表明国际航行船舶携带病媒生物不仅与挂靠港口有关，也与船舶的管理有密切关系。调查发现，中国、中国香港港籍的船舶均为中国船员管理，卫生意识较差，尤其是厨房卫生，如垃圾桶不加盖、生熟不分、食物保存温度不达标等，使船舶上产生较多病媒生物孳生场所，给肠道疾病的传播提供了渠道。另一方面，往来于日本、台湾、香港的船舶大多为集装箱班轮，挂港时间较短，通常12小时内就可完成装卸货出港，所以客观上造成船员工作量较大，没有时间整理船舶卫生和口岸卫生监督较为困难的情况，导致上述地区截获病媒生物较多。2012-2015年监测发现3种非本地种的输入性病媒生物，蓝翠蝇、厚环黑蝇和凯氏酪蝇，均为船籍为巴拿马的国际船舶携带，分别来自南非、委内瑞拉和巴拿马，表明媒介输入的风险客观存在，应予以关注。从密度变化看，2012-2015年入境船舶截获媒介的平均密度为11.87%，各年度密度变化呈现双峰型，主要集中在5-6月和9-10月。这提示口岸应当加强在重点时期的查验，对发现有问题的船舶及时进行卫生处理。56 第四章黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组分析第四章黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组分析随着口岸的进一步扩大开放，病媒生物防控工作面临着新形势下的新挑战。一是传统生物学鉴定方法耗时、人力成本高、限制于样本的发育阶段、性别和完整度，在快速通关、应对非技术性贸易壁垒方面显现了弱势；二是国际疫情疫病多发频发，特别如利什曼病、登革热、寨卡热等虫媒传染病在近年来多次暴发，面对这些国内少见的疫情疫病，如何有效检出成为了发展的关键问题；三是口岸有害生物以化学防治为主，所产生的“3R”问题日益突出，同时口岸主要熏蒸剂溴甲烷将逐步退出使用，对病媒生物防控方法提出了新的要求。面对病媒生物防控工作的新挑战，转录组学为研究者提供了病媒生物在整体水平转录上的大数据平台，为口岸病媒生物研究打开了新突破口。转录组学（transcriptomics），是一门基于转录组在整体水平之上研究生物基因转录情况的[98]学科。基于转录组，可以快速、全面的得到目标生物的整体转录活动情况。目前转录组研究在昆虫学代谢途径分析、新基因发掘、功能基因发现、基因差异表达研究、分子标记的发现等方面有着较为广泛的应用。同时，在病媒生物研究方面，可以提供病原体检测的新途径。所以，转录组技术可以为病媒生物分子生物学研究提供一个庞大的数据平台，对于物种分子鉴定、病原体的分子生物学研究、抗药性研究或者防控机制研究等方面，均有重要的助推作用。黑胸大蠊PeriplanetafuliginosaServille和澳洲大蠊Periplanetaaustralasiae(Linnaeus)是我国重要的病媒生物，是南方常见的大蠊种类，适应能力、繁殖能力、行动能力很强，能机械携带痢疾杆菌、大肠杆菌等肠道传染病病原体、病毒、霉菌和蛔虫卵，对公共卫生安全造成影响。但目前对这两种蜚蠊的分子生物学研究却不多，对其分子生物学信息知之甚少。所以本章对黑胸大蠊和澳洲大蠊进行了转录组测序，并对组装后基因进行了基因功能注释，获得了大量的黑胸大蠊和澳洲大蠊分子生物学信息，为今后开展相关研究提供基础数据。1材料与方法1.1试验材料黑胸大蠊采自浙江省温州市七里港码头食堂，编号HX330420151028；澳洲大蠊采自浙江省温州市，编号AZ3304005。采集的活虫迅速放入液氮冷冻。1.3试验方法1.3.1试虫RNA的提取、转录组测序及数据分析将液氮冷冻的试虫送至杭州联川生物科技有限公司，使用Trizolreagent试剂57 西南大学硕士学位论文盒(Invitrogen,CA,USA)提取RNA。RNA质量和纯度使用Bioanalyzer2100和RNA6000NanoLabChipKit(Agilent,CA,USA)分析。将满足测序质量要求的黑胸大蠊和澳洲大蠊RNA样品送至杭州联川生物科技有限公司进行转录组测序及原始数据分析，流程如下：1.3.2.1建库试验流程使用连接有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA。经抽提的mRNA被片段化试剂（FragmentationBuffer）随机打成短片段，以片段化的mRNA为模板，用六碱基随机引物（Randomhexamers）合成一链cDNA，随后加入缓冲液、dBTPs、RNaseH和DNAPolymeraseⅠ进行二链cDNA合成。AMPureXPbeads纯化双链产物，利用T4DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶将DNA的粘性末端修复为平末端，3’末端加碱基A并接头，AMPureXPbeads进行片段选择，最后进行PCR扩增获得最终测序文库，文库质检合格后用IlluminaHiseq4000进行测序，测序策略为pairedend（图4-1）。图4-1转录组测序流程Fig.4-1Thesequencingprocessfortranscriptome1.3.2.2转录组信息分析流程本研究进行的无参转录组高通量测序主要分析内容是测序数据拼接、拼接结果功能注释、基因表达和基因表达差异水平的衡量，其次是基于转录本信息深度58 第四章黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组分析挖掘包括SNP和SSR分析、CDS预测等。分析流程见图4-2。图4-2转录组数据分析流程Fig.4-2Theprocessoftranscriptomeanalysis（1）测序数据的预处理高通量测序仪器获得的paired-end原始数据（通常为2*125bp），其中可能含有分别由建库过程引入和测序仪器本身产生的带接头的和低质量的测序数据。为确保分析准确可信，需要对原始数据进行预处理，得到有效数据（ValidData），以用于后续信息分析。其步骤如下：a.去除带接头（Adaptor）的readsb.去除含有N（N表示无法确定碱基信息）的比例大于5%的readsc.去除低质量Reads（质量值Q≤10的碱基数占整个read的20%以上）d.统计原始测序量、有效测序量、Q20、Q30和GC含量（2）Trinity拼接使用Trinity软件（版本2013-02-05）进行数据拼接。主要分为3步：a.Inchworm：构建k-mer库，K-25.过滤低频k-mer，选择最高频度的k-mer作为种子（不包括复杂度和单一的k-mers，一次用完即从k-mer库中剔除），用来Contig组装。以k-mer间overlap长度等于k-1对种子进行延伸，直到不能再延伸，59 西南大学硕士学位论文形成线性Contig。b.Chrysalis：把可能存在可变剪切及同源基因的Contigs聚类。每个Contig集定义成一个Component，对每个Component构建deBruijngraphs。通过reads映射验证，查看每个Component的reads支持情况。c.Butterfly：合并在deBruijn图中有连续节点的线性路径，以形成更长的序列。剔除可能由于测序错误的分叉，使边均匀。用动态规划算法打分，鉴定被reads和readpairs支持的路径，剔除reads支持少的路径。（3）Transcript功能注释拼接获得Transcripts后，与5个公共数据库（Swiss-Prot、NR、KEGG、COG-10和Pfam）中的蛋白质序列进行比对，取阈值e≤10，通过序列相似性进行功能注释。序列相似性比较主要使用BLAST算法。2结果与分析2.1黑胸大蠊转录组分析2.1.1RNA提取结果提取到的黑胸大蠊RNA浓度为0.24µg/µL，A260/280的值为2.07，A260/230的值为1.98，表明得到的RNA样品纯度高，没有小分子和蛋白质的杂质（图4-3）。图4-3黑胸大蠊RNA提取结果Fig.4-3ResultofRNAextractedfromPeriplanetafuliginosa2.1.2转录组测序及基因注释2.1.2.1数据产出和产量统计黑胸大蠊转录组样品数据量为13.63G，总的CG含量为44.15%，数据中98.04%的reads的质量参数Q≥20，有95.64%的reads的质量参数Q≥30。2.1.2.2数据组装质量上述数据经过分析，共获得54964个转录本，总长度57753395bp，最短201bp，最长27693bp，平均长度为1050bp。其中200-299bp的有13027个，占23.70%；60 第四章黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组分析300-499bp的有13143个，占23.91%；500-999bp的有12527个，占22.79%；1000-1999bp的有8958个，占16.30%；2000bp及以上的有7309个，占13.30%。序列分析共获得39576个unigene基因，总长度32297597bp，最短201bp，最长27693bp，平均长度816bp。其中200-299bp的有11133个，占28.13%；300-499bp的有10631个，占26.86%；500-999bp的有8918个，占22.53%；1000-1999bp的有8894个，占22.47%；2000bp及以上的有3457个，占8.74%（图4-4）。图4-4黑胸大蠊unigene长度分布图Fig.4-4LengthdistributionoftheunigeneinPeriplanetafuliginosatranscriptome2.1.2.3.unigene在各数据库中的比对结果将获得的39576个unigene与5个公共数据库（Swiss-Prot、NR、KEGG、COG-10和Pfam）中进行比对，取阈值e≤10，共获得61167个结果，各数据库获得的数据量见表4-1。61 西南大学硕士学位论文表4-1黑胸大蠊及澳洲大蠊转录组基因注释统计表Table4-1FunctionalannotationofthePeriplanetafuliginosaandPeriplanetaaustralasiaetranscriptome物种unigene数量Swiss-ProtNRPfamKEGGCOGGOSpeciesunigenenumber黑胸大蠊39576946115289105847109101108614Periplanetafuliginosa100%23.91%38.63%26.74%17.96%25.55%21.77%澳洲大蠊244047056112497859530975066497Periplanetaaustralasiae100%28.91%46.09%32.20%21.75%30.76%26.62%2.1.3转录本功能分类本研究共有8614个unigene在GO数据库中3大类50个功能组中找到对应（图4-5），其中BiologicalProcess组中较大的是transcriptionDNA-dependent、regulationoftranscription；CellularComponent组中较大的是integraltomembrane、nucleus和cytoplasm；MolecularFunction组中较大的是ATPbinding。图4-5黑胸大蠊unigene的GO分类Fig.4-5GOclassificationoftheunigeneinPeriplanetafuliginosatranscriptome2.1.3.2KEGG分类注释本研究共有7109条黑胸大蠊的转录本在KEGG中被注释。其中被注释为“SignalTransduction”的最多，有655条，占9.21%，其次为“TransportandCatabolism”，共540条，占7.60%，见图4-6。62 第四章黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组分析图4-6黑胸大蠊KEGG通路分类注释图Fig.4-6KEGGPathwayclassificationoftheunigeneinPeriplanetafuliginosatranscriptome2.1.3.3COG分类注释共有10110条转录本在COG中被注释，其中最多的组为“Generalfunctionpredictiononly”，最少的组为“Cellmotility”（图4-7）。图4-7黑胸大蠊COG功能分类Fig.4-7COGfunctionalcategoriesofthetranscriptinPeriplanetafuliginosatranscriptome2.1.4CDS预测本研究中共13757条序列可被编码，占全部基因的34.76%。2.1.5SNP突变形态统计本研究以测序深度≥100作为阈值，共发现黑胸大蠊SNP置换（transition）33955个，其中A-G16958个、C-T16997个；颠换（transversion）16561个，其63 西南大学硕士学位论文中，A-C3948个、A-T5167个、C-G3333个、G-T4113个（表4-2）。表4-2黑胸大蠊及澳洲大蠊SNP位点类型Table4-2SummaryofSNPsfromtranscriptomeofPeriplanetafuliginosaandPeriplanetaaustralasiae无测序深度测序深度100nodepthfilter100depthfilterSNP类型黑胸大蠊澳洲大蠊黑胸大蠊澳洲大蠊SNPtypePeriplanetaPeriplanetaPeriplanetaPeriplanetafuliginosaaustralasiaefuliginosaaustralasiae置换Transition106563716793395521234A-G53342359711695810636C-T53221357081699710598颠换Transversion60371410701656111154A-C14374973939482665A-T191621349951673458C-G11979790433332295G-T14856992841132736总计Total16693411274950516323882.1.6微卫星位点分析通过软件分析，黑胸大蠊共找到2666个微卫星序列，发生率为4.85%。其中单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复SSR序列分别为687、740、1036、127、51、25条，依次占25.77%、27.76%、38.86%、4.76%、1.91%、0.94%。其中，三核苷酸重复占比最高，为优势重复类型，二核苷酸重复和单核苷酸重复占比相似，分别居于第二、第三的位置。统计黑胸大蠊不同核苷酸重复基元的重复次数，结果发现，单核苷酸重复序列重复次数均大于等于12；二核苷酸重复序列重复次数在6-12之间；三核苷酸重复序列重复次数均在5-8之间；四核苷酸重复序列重复次数均在5-6之间；五核苷酸重复序列重复次数在4-5之间；六核苷酸重复序列重复次数均为4（表4-3）。64 第四章黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组分析表4-3黑胸大蠊和澳洲大蠊不同类型SSR重复次数统计表Table4-3SummarySSRidentifiedinPeriplanetafuliginosaandPeriplanetaaustralasiaetranscriptome重复次数单核苷酸重复二核苷酸重复三核苷酸重复四核苷酸重复五核苷酸重复六核苷酸重复黑胸大蠊澳洲大蠊黑胸大蠊澳洲大蠊黑胸大蠊澳洲大蠊黑胸大蠊澳洲大蠊黑胸大蠊澳洲大蠊黑胸大蠊澳洲大蠊4000000004424251450000530241113563710060031220923411114563000070016171262194000000800793910170000009006021000000001000572200000000110066320000000012199112510000000013124620000000000146753000000000015533000000000001624210000000000172325000000000018233700000000001931460000000000206242000000000021-2481620000000000合计6874907403951036563127565125251465 西南大学硕士学位论文2.2澳洲大蠊转录组分析2.2.1RNA提取结果提取到的澳洲大蠊RNA浓度为0.28µg/µL，A260/280的值为2.07，A260/230的值为1.53，提取结果见图4-8。图4-8澳洲大蠊RNA提取结果Fig.4-8ResultofRNAextractedfromPeriplanetaaustralasiae2.2.2转录组测序及基因注释2.2.2.1数据产出和产量统计澳洲大蠊转录组样品数据量为7.19G，总的CG含量为39.06%，数据中95.28%的reads的质量参数Q≥20，有89.73%的reads的质量参数Q≥30。2.2.2.2数据组装质量共获得29160个转录本，总长度21385175bp，最短201bp，最长10853bp，平均长度为733bp。其中200-299bp的有8373个，占28.71%；300-499bp的有7588个，占26.02%；500-999bp的有6849个，占23.49%；1000-1999bp的有4398个，占15.08%；2000bp及以上的有1952个，占6.69%。上述数据经过分析，共获得24404个基因，总长度16583410bp，最短201bp，最长10853bp，平均长度679bp。其中200-299bp的有7634个，占31.28%；300-499bp的有6613个，占27.10%；500-999bp的有5521个，占22.62%；1000-1999bp的有3279个，占13.44%；2000bp及以上的有1357个，占5.56%（图4-9）。66 第四章黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组分析图4-9澳洲大蠊unigene长度分布图Fig.4-9LengthdistributionoftheunigeneinPeriplanetaaustralasiaetranscriptome2.2.2.3.转录本在各数据库中的比对结果将本研究获得的24404个unigene提交至与5个公共数据库（Swiss-Prot、NR、-10KEGG、COG和Pfam）中的蛋白质序列进行比对，取阈值e≤10，共获得45476个结果，各数据库获得的数据量见表4-1。2.2.3转录本功能分类2.2.3.1GO分类注释本研究共有6497个转录本在GO数据库中3大类50个功能组中找到对应（图4-10），其中BiologicalProcess组中较大的是transcription,DNA-dependent、regulationoftranscription；CellarComponent组中较大的是integraltomembrane、nucleus和cytoplasm；MolecularFunction组中较大的是ATPbinding。67 西南大学硕士学位论文图4-10澳洲大蠊转录本GO分类Fig.4-10GOclassificationoftheunigeneinPeriplanetaaustralasiaetranscriptome2.2.3.2KEGG分类注释本研究中共有5309条澳洲大蠊的转录本在KEGG中被注释。其中被注释为“TransportandCatabolism”的最多，有421条，占7.93%；其次为“SignalTransduction”有387条，占7.29%；“CarbohydrateMetabolism”有380条，占7.16%；“LIpidMetabolism”，共342条，占6.44%;“AminoAcidMetabolism”有335条，占6.31%；见图4-11。图4-11澳洲大蠊KEGG通路分类注释图Fig.4-11KEGGPathwayclassificationoftheunigeneinPeriplanetaaustralasiae68 第四章黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组分析transcriptome2.2.3.3COG分类注释共有7506条转录本在COG中被注释，其中最多的组为“Generalfunctionpredictiononly”，最少的组为“Cellmotility”（图4-12）。图4-12澳洲大蠊COG功能分类Fig.4-12COGfunctionalcategoriesoftheunigeneinPeriplanetaaustralasiaetranscriptome2.2.4CDS预测本研究中共8844条序列可被编码，占全部基因的36.24%。2.2.5SNP突变形态统计本研究以测序深度≥100作为阈值，共发现澳洲大蠊SNP置换（transition）21234个，其中A-G10636个、C-T10598个；颠换（transversion）11154个，其中，A-C2665个、A-T3458个、C-G2295个、G-T2736个（表4-2）。2.2.6微卫星位点分析澳洲大蠊共找到1543个微卫星序列，发生率为6.32%。其中单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复SSR序列分别为490、395、563、56、25、14条，依次占31.76%、25.60%、36.49%、3.63%、1.62%、0.91%。其中，三核苷酸重复占比最高，为优势重复类型，单核苷酸重复和二核苷酸重复分别居于第二、第三的位置。通过统计黑胸大蠊不同核苷酸重复基元的重复次数，结果发现，澳洲大蠊和黑胸大蠊相同核苷酸重复基元的重复次数范围一致（表4-3）。3讨论为获得黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组信息，本研究对其进行了高通量的转录组测序，通过序列的预处理Trinity拼接、Transcript功能注释等步骤，得到了数据69 西南大学硕士学位论文量为13.63G的黑胸大蠊转录组信息，数据量为7.19G的澳洲大蠊转录组信息。数量巨大的黑胸大蠊和澳洲大蠊转录本信息可为其今后的基因鉴定和分子标记鉴定提供有价值的信息。[103][101]从转录组测序质量来看，较桔小实蝇、柑橘粉虱的测序质量有了明显的提升，序列长度增长；黑胸大蠊和澳洲大蠊的transcripts平均长度分别为1050bp和733bp，高于柑橘粉虱的平均长度497bp和桔小实蝇的456bp，和美洲大蠊771[102]的平均长度接近。同时，2000bp及以上的transcripts和unigene比例也大幅增加，黑胸大蠊和澳洲大蠊均在5.5%以上，而柑橘粉虱和桔小实蝇在1.85%以下。原始数据的质量参数中，黑胸大蠊98.04%的reads的质量参数Q≥20、澳洲大蠊95.28%的reads的质量参数Q≥20，超过桔小实蝇的91.2%。有研究表明，序列长[101;102]度是影响注释的重要因素，从本研究获得的数据看出，随着高通量测序的不断发展，其质量不断提升，越来越能为研究者探索生物基因大数据提供帮助。在测序质量相似的情况下，澳洲大蠊（39576条）和黑胸大蠊（24404条）的unigene数量明显少于美洲大蠊睾丸（125390条），表明不同种的大蠊unigene数量差距巨大。从数据库注释上看，黑胸大蠊和澳洲大蠊趋近一致。GO是基因本体联合会（GeneOntologyConsortium）所建立的数据库，提供了三类描述的系统定义方式，用于描述基因产物的功能：分子生物学上的功能（MolecularFunction）、生物学途径（BiologicalProcess）和在细胞中的组件（CellarComponent）。在GO注释上，黑胸大蠊和澳洲大蠊“BiologicalProcess”组中较大的均是“transcriptionDNA-dependent”、“regulationoftranscription”；“CellarComponent”组中较大的均是“integraltomembrane”、“nucleus”和“cytoplasm”；“MolecularFunction”组中较大的均是“ATPbinding”。COG是Clustersoforthologousgroupsforeukaryoticcompletegenomes（真核生物至系统原蛋白族）的缩写，构成每个COG的蛋白都是被假定来自一个祖先蛋白，orthologs或者paralogs。Orthologs是指来自不同物种的垂直家系进化而来的蛋白质，并保留与原始蛋白相对应的功能。Paralogs是指在一定物种中的来源于基因复制的蛋白，可能会进化出新的与原来有关的功能。在COG注释上，最多的组均为“Generalfunctionpredictiononly”，最少的组均为“Cellmotility”。但黑胸大蠊在“I:Lipidtransportandmetabolism”及“Y:Nuclearstructure”两项比例少于澳洲大蠊，表明黑胸大蠊在脂质运输和代谢、细胞核结构两项功能上的相关蛋白质较少。其他项目两者相似。KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）是系统分析基因功能、基因组信息数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。70 第四章黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组分析KEGG提供的整合代谢途径(pathway)查询包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代谢及有机物的生物降解，是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究的强有力工具。在KEGG注释上，“SignalTransduction”信号转导和“TransportandCatabolism”[104]运输和分解代谢均为第一二位，表明两种蜚蠊代谢功能旺盛。但澳洲大蠊在“ImmuneSystem”免疫系统上的比例明显少于黑胸大蠊，在“MetabolismofCofactorsandvitamins”辅酶因子和维他命代谢和“Folding,SortingandDegradation”上比例高于黑胸大蠊。两种蜚蠊的KEGG功能鉴定为研究其体内特殊的进程、功能和通路提供了有价值的资源。从遗传标记来看，本研究关注的为SNP及SSR。SNP全称SingleNucleotidePolymorphisms，指的是基因组上单个核苷酸的变异形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰度，基因组上单个核苷酸的变异包括置换、颠换、缺失和插入，较容易通过高通量转录组测序被找到。SNP本研究发现黑胸大蠊SNP置换（transition）33955个、颠换（transversion）16561个，澳洲大蠊SNP置换（transition）21234个、颠换（transversion）11154个。可为今后相关的研究提供帮助。微卫星又称简单重复序列（SimpleSequenceRepeat,SSR），指的是基因组中由1-6个甘酸组成的基本单元构成的一段DNA，广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，且分布较平均，平均每10kb的碱基就会出现一个微卫星序列，其长[99]度一般在200bp以下。微卫星包括核心序列和两侧保守的侧翼序列。微卫星具有共线性、高度重复性、高丰度的多态性等优点，成为构建遗传连锁图谱、研究[100]群体遗传学、进行分子标记筛选的理想工具。随着转录组的普及应用，越来越[101;102]多的研究者通过转录组数据库发掘微卫星位点。利用转录组数据开发的SSR标记称为基因微卫星（genemicrosatellites），具有步骤简便、效率高、大批量、耗时短、经济性的特点。在本研究中，基于转录组的SSR检测是以组装出来的gene作为参考序列，使用SSR软件MiscroSAtellite（MISA）发掘SSR，参数设置为单核苷酸重复的次数在≥16，二核苷酸重复的次数在≥6，三至四核苷酸重复的次数在≥5次，五至六核苷酸重复的次数在≥4，以期获得可供其种群遗传学研究所需的分子标记。从黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组数据库中分别筛选得到SSR序列2666和1543条，发生率分别为4.85%和6.32%。均低于美洲大蠊（14195条，发生率11.27%），这可能与转录组数据大小有关。由于传统开发SSR的方法耗时较长、成本较高，目前关于黑胸大蠊和澳洲大蠊SSR开发的研究未见报道。尽管未进行PCR验证，但已有诸多研究者表明，可通过转录组设计引物并扩增SSR序列，[105;106]转录组数据库可以为SSR标记的开发提供可靠的资源。由高通量转录组测序开发SSR，将会极大地促进这一工作，本研究将为黑胸大蠊和澳洲大蠊后续的多态性检测和种群遗传结构的研究奠定坚实基础。71 西南大学硕士学位论文从基因同源性分布来看，基因数据库中的参考序列的数量是决定转录组数据库注释的另一大因素。由于数据共享的原因，数据库中关于大蠊的转录组基因序列较少，较难对本次研究起到参考作用，但已有的少量黑胸大蠊、澳洲大蠊、褐斑大蠊的基因序列为本研究提供了便利。相比于其他昆虫，黑胸大蠊、澳洲大蠊的基因信息仍然严重匮乏，分子生物学研究滞后，本实验将对两种大蠊的转录组测序将推进其研究向更高水平发展。72 第五章主要结果、结论及研究展望第五章主要结果、结论及研究展望1摸清了温州口岸病媒生物的基本情况2012-2015年，温州七里港码头捕获病媒生物标本18866号，隶属9科23属33种。其中鼠形动物72头，隶属2科4属6种；优势种为臭鼩鼱，占比75.00%；各年平均密度分别为0.78%，1.31%，0.71%，0.46%，密度呈下降趋势，总体上低于国家防控密度标准；密度变化呈双峰消长型（前高峰在9月份，后高峰为12月）；监测到粒形硬蜱1种体表寄生虫，未监测到蚤、螨。蚊类5436头，隶属2科4属6种；优势种为致倦库蚊，占比69.24%；各年度平均密度分别为4.04头/(台*小时)、7.93头/(台*小时)、8.37头/(台*小时)、6.15头/(台*小时)，总体的密度水平处于较低位置，未达到国家防控标准；密度变化呈单峰消长型，夏季为活动的高峰时期。蝇类13355头，隶属4科14属20种；种群结构较为稳定，以大头金蝇（占比50.85%）、丝光绿蝇（占比28.79%）为主；密度变化呈单峰消长型，各年平均密度分别为104.00头/笼、253.80头/笼、151.94头/笼、274.50头/笼，活动高峰为7月。2012-2015年，温州龙湾国际机场捕获病媒生物35515头，隶属10科19属29种，鼠、蚊、蝇、蠊种类和南方地区优势种类一致。其中鼠形动物95头，隶属2科4属6种；各年密度分别为1.08%、0.91%、1.67%、0.72%，无显著性变化，2012、2014年平均密度超过1%，提示口岸应当严控鼠密度；密度变化呈单峰型，密度高峰集中在6-8月；种群结构稳定，优势种为臭鼩鼱，占比42.11%；未发现蚤、蜱、螨等鼠表寄生虫。蚊类5342头，隶属2科3属5种；各年度平均密度分别为6.56头/(台*小时)、7.49头/(台*小时)、7.47头/(台*小时)、3.22头/(台*小时)，没有显著性变化；密度变化呈现单峰型，集中在夏季；以致倦库蚊为主，占比74.22%，种群构成发生了显著性的改变。蝇类20423头，隶属4科10属14种；各年平均密度分别为312.61头/笼、257.00头/笼、276.67头/笼、288.33头/笼，2013、2015年密度超过控制标准；密度变化呈单峰消长型，每年的7月为蝇类活动的高峰时期；种群结构较为稳定，以大头金蝇、丝光绿蝇为主，分别占比59.91%和24.29%。蜚蠊9655头，隶属2科2属4种；各年平均密度分别为8.36头/张、8.89头/张、8.83头/张、5.88头/张，显著高于浙江省整体水平；种群构成稳定，优势种为德国小蠊，占比96.99%；全年均有活动，高峰为5-6月。2掌握了温州口岸输入性病媒生物的基本情况2012-2015年温州口岸自入境集装箱中截获输入性病媒生物823头，隶属4目10科19属31种，检出率5.63%。发现9种非本地种的输入性病媒生物，分别为绯胫纹蝇、厚环黑蝇、巴浦绿蝇、古铜黑蝇、凯氏酪蝇、蓬勃花蜱、图兰璃眼蜱、73 西南大学硕士学位论文丽表花蜱和彩饰花蜱。集装箱截获的病媒生物以蝇类为主，占80.07%；其次为蜱（10.57%）、蜚蠊（8.51%）；蚊类和鼠类占比较少。截获的病媒生物分布于35个国家和地区，其中占比最高的5个国际和地区为：宁波内支线、南非、美国、乌拉圭和澳大利亚，货物主要为盐湿牛皮。截获高峰集中在6-10月。2012-2015年温州口岸自入境船舶中截获输入性病媒生物80头，隶属2目6科10属14种，检出率5.04%。发现3种非本地种的输入性病媒生物，分别为蓝翠蝇、厚环黑蝇和凯氏酪蝇。入境船舶截获的病媒生物主要是蝇类和蜚蠊，分别占比52.50%和47.5%。截获病媒生物的船舶来源地于10个国家和地区，主要为中国台湾、中国香港和日本。中国、中国香港和巴拿马的船舶携带输入性病媒生物较多。截获高峰主要集中在5-6月和9-10月。3温州口岸虫媒传染病传播和外来生物定殖的风险客观存在，应当加强病媒生物防控研究发现，温州七里港码头和龙湾国际机场的病媒生物种群结构、季节消长、种类构成较为稳定，表明客观上已经具备传播疾病的能力，存在相关虫媒传染病发生和发展的风险，应当引起高度重视。特别是蝇类和蜚蠊密度较高，提示口岸肠道传染病传播的风险较大。近年来口岸查验的集装箱查验数量、比例大幅下降，但截获的病媒生物数量却大幅提升，同时，入境船舶也携带的大量输入性病媒生物，表明温州口岸面临外来病媒生物定殖的风险、输入性病媒生物传播疾病的风险激增。尤其是蝇类适应和繁殖能力较强，在装有盐湿牛皮的集装箱中可存活并繁殖，输入性风险较大，可能对本地生态和公共卫生安全造成影响。研究发现各类病媒生物种群结构受生境改变的影响较大，口岸可以这一特点，加强病媒生物滋生地的改造，根据其生态习性，改变生存条件，减少媒介在环境中的容纳量，达到控制其滋生繁殖的目的。同时加强了健康教育和防制技术宣传，加强对重点部位、重点人员的不良卫生习惯的干预，最大限度的减少人、媒介、病原体的接触。在实施化学防制时，应当根据不同病媒生物的季节消长规律选择恰当时机，保证灭杀效果，减少对环境的损害。同时，应当加强对装载盐湿牛皮的集装箱的监管，重点关注南非、美国、乌拉圭和澳大利亚等国的入境集装箱，强化对船港籍为中国、中国香港和巴拿马的船舶的卫生监督，及时对发现问题的船舶和集装箱实施有效的卫生处理。4获得了黑胸大蠊和澳洲大蠊的转录组数据本研究对黑胸大蠊和澳洲大蠊进行了高通量的转录组测序。黑胸大蠊转录组信息数据量为13.63G，共获得54964个转录本，总长度57753395bp；进一步分析74 第五章主要结果、结论及研究展望后获得39576个unigene基因，总长度32297597bp，最短201bp，最长27693bp，平均长度816bp。将unigene在Swiss-Prot、NR、KEGG、COG和Pfam5个公共数据库中比对，共获得61167个结果。发现黑胸大蠊SNP置换（transition）33955个，颠换（transversion）16561个，找到2666个微卫星序列。澳洲大蠊转录组信息数据量为7.19G，共获得29160个转录本，总长度21385175bp；进一步分析后获得24404个基因，总长度16583410bp，最短201bp，最长10853bp，平均长度679bp。将unigene在Swiss-Prot、NR、KEGG、COG和Pfam5个公共数据库中比对，共获得45476个结果。共发现澳洲大蠊SNP置换（transition）21234个，颠换（transversion）11154个，找到1543个微卫星序列。数量巨大的黑胸大蠊和澳洲大蠊转录本信息可为其今后的基因鉴定和分子标记鉴定提供有价值的信息。5研究展望本研究摸清了温州口岸病媒生物的种群构成、密度、季节消长等本底情况，掌握了温州口岸输入性病媒生物的种类、来源、载体等信息，对温州口岸病媒生物情况有了全面的了解，为科学防控虫媒传染病提供了有利数据支撑。下一步，研究将基于温州口岸病媒生物本底情况及输入性病媒监测情况，结合温州入出境交通工具、旅客以及国际疫情动态，对温州口岸虫媒传染病及外来病媒的生物安全进行风险分析，提出防控对策及应急预案。另一方面，研究将对转录组数据进行进一步整理分析，开发以COI基因、16SrRNA基因和Cytb基因三者为核心的生物信息码作为黑胸大蠊和澳洲大蠊的分子标记进行快速鉴定，最大程度实现媒介生物鉴定的高效化、便捷化、批量化和精确化，解决长期存放样品的鉴定、媒介生物残体的鉴定、各种虫态的鉴定、批量化的精确鉴定、单一DNA条形码失效情况下的鉴定这五大问题，建立完善、准确、全面的生物信息码鉴定技术，实现口岸媒介生物鉴定的新突破。75 西南大学硕士学位论文76 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致谢致谢时光荏苒、白驹过隙，3年的时间如水一般划过，仿佛不想留下一丝痕迹，读研3年就如同这水一般匆匆而逝，想抓很多，却被它悄悄溜走，但有一些珍贵的记忆却是被滋润在了心田。首先我要用我最真挚的感谢，感谢我的导师王进军教授。王老师是带我进入科学殿堂的引路人，他教会了我如何用去伪存真的思维去认识问题，如何用科学的逻辑去思考问题。王老师最令我敬佩的是他的为人，他人性的光芒和巨大的人格魅力无时无刻不在影响着我。作为一个身兼数职的领导、一个桃李满园的教授，他对待每个学生仍然保持着初心，以一个伟大教者的仁师之心关爱、教导我们。他用自身的言行，诠释了“真诚”、“勤奋”，这些宝贵的品质持续影响着我的人生。对我而言，王进军老师更在我人生的关键选择上帮助了我，他用无私、善良和睿智诠释了伟大，是我一生都会感激的恩师。我还要感谢在研究生过程中悉心指导我、帮助我的其他老师。感谢魏丹丹老师，他对我硕士论文的框架搭建、内容的完善起到了至关重要的作用。感谢王亨洪老师和刘怀老师两位院领导对我的照顾；感谢王宗庆和车艳丽老师对我论文的宝贵建议；感谢刘映红老师待我像自己学生一样的热情；感谢窦威老师对我答辩、开题等等的帮助；感谢和我亦师亦友的夹福先老师、申光茂老师、魏冬老师，我们在实验室有共同的感动和进步。还要感谢胡伟伟老师对我的关心，感谢刘秋艳老师对我成长的帮助。感谢在病媒生物监测调查过程中给我悉心指导的上海检验检疫局曹敏老师、温州检验检疫局陈建国、刘峰处长，感谢在调查一线一起奋战的谢建雄科长、周映雪科长、吴俊璐、郑宏伟、胡崇阳、潘瑜、陈勤峰等等。感谢王柯依、李亚丽、冯英财等师弟师妹，帮我下载文献、办理相关的事务。感谢我的爱人江化琴对我论文的细致修改、对我生活的关心。感谢父母一直支持我、鼓励我成长进步。人应当常怀感恩之心，感恩对待每一位在生命旅途中帮助过、关心过你的人。是你们帮助了我的成长，让我体会到爱的力量，再次感谢你们！87
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