植物基因转化与转基因植株鉴定

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1、植物基因转化与转基因植株鉴定一、相关背景知识和实验原理（一）相关背景知识链接应用DNA重组技术构建植物表达载体，通过农杆菌转化双子叶植是目前比较常用的植物转化方法。利用表达载体上的筛选标记在转化植株培养时进行筛选。同时，目标基因与GUS基因共同转化，在转化植株通过GUS染色，能够鉴定出转基因植株。整个实验过程大约一个月左右可以鉴别出转化苗。（二）实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有

2、一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。通过基因克隆与重组技术将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。图1图1外源基因转化流程图三、实验目的和实验要求目的：学习和掌握从基因分离克隆到植株转化及转基因植株的筛选整个实验体系。要求：综合利用前面的单个实验环节所掌握的知识，获得完整的实验理念，并在实验过程中学会设计、构建适合的载体并将外源基因转化植株。四、实验材料和方

3、法（一）实验仪器PCR仪，凝胶成像系统，台式高速离心机，台式高速冷冻离心机，DU640紫外分光光度计，UV-2450分光光度计，精密pH计，微量移液器，控温摇床，电子天平，制冰机，-80C超低温冰箱，电热恒温水浴锅，自动电热压力蒸汽灭菌器，超净工作台，光照培养箱等（二）试剂及配方Trizol试剂，RevertAid™FirstStrandcDNASynthesisKit，DNaseI，2×PCRMasterMix，FastDigest限制性内切酶，T4DNALigase，PrimeSTARTMHSDNAPolymerase高保真酶，pEAS

4、Y-BluntC，质粒提取试剂盒（E.Z.N.A.GelExtractionKit），凝胶回收试剂盒（E.Z.N.A.PlasmidMiniKitI），DNA提取试剂盒，Kanamycin（Kan），Ampicillin（Amp），Carbenicillin（Cb），电泳缓冲液，LB培养基、YEB培养基，烟草培养基如下表1.表1烟草培养基表（单位:mg/L）Table1Listoftobaccoplantsculturemedia(mg/L)培养基类型基本培养基6-BAIAAKanCb种子萌发培养基MS----分化培养基MS30.1--生根培

5、养基MS-0.5--选择分化培养基MS30.150400选择生根培养基MS-0.5100400（三）实验步骤1.引物设计采用Oligo7对玉米ZmMKK4序列（GenBank序列号：GU942956.1）进行引物设计，引物设计原则及方法见（第五章实验二十四核酸序列分析和引物设计）。为了便于酶切，我们在分别在上游引物5’端加上BamHⅠ酶切位点（下划线部分）保护碱基，下游引物5'端加上SalⅠ酶切位点（下划线部分）和保护碱基，得到如下序列：上游引物F-ZmMKK4：5'-GCGGGATCCATGAGGCCGGGCGGGCC-3'下游引物R-Zm

6、MKK4：5'-GCGGTCGACGGATTTCGGCGAGCCATCATGAC-3’2.RNA提取及反转录成cDNA（1）玉米总RNA的提取玉米总RNA的提取采用Trizol（Invitrogen）试剂法，具体操作如下：1)取2g～5g新鲜玉米叶片液氮中充分研磨后加入到1ml的Trizol中，涡旋5min～10min。2)放置5min，在低温冷冻离心机中12000×g，4C离心10min。3)将上清液转移至另一个新的干净的2ml离心管中，加入200μL氯仿，轻轻摇动均匀，常温放置5min。4)4C，<12000×g离心15min。5)小

7、心的将上层水相转移至新的离心管后，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀后常温放置10min。4C，<12000×g离心10min.6)去掉上清液，用75%乙醇（无水乙醇：DEPC水=3：1）洗涤。4C，<7500×g离心5min。7)去掉上清液，并在干燥空气中晾干（约5min～10min）8)根据沉淀的量加入30μL～50μL的RNase-free水，55C～60C处理10min溶解。9)分光光度计测定提取的总RNA光密度值，冰上保存进行后续实验或-80C保存。（2）cDNA合成1）在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物1μg～5μgRNA1

8、μLOligo(dT)15或Randomprimer，补RNase-freeddH2O至12.4μL；2）进行变性退火反应70C，5min,短时离心后冰浴5min