鸡大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及初步应用.pdf

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1、分类号Q95单位代码10447密级无研究生学号1310190104硕士学位论文论文题目鸡大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及初步应用作者姓名吴伟胜专业名称动物学指导教师李玉保副教授学院农学院论文提交日期2016年6月原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，论文中不含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得聊城大学或其他教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：日期导师签名：日期摘

2、要禽大肠杆菌病是由某些致病性或条件致病性大肠杆菌引起，该病一年四季均可发生，但以冬春季节和气温多变时期多发，给养禽业带来巨大的经济损失。禽大肠杆菌病在临床上主要表现有大肠杆菌败血症、气囊炎、肉芽肿、肝周炎、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎等症状，养殖企业通常使用抗生素防治该病，但由于抗生素的盲目添加或过量使用，导致大肠杆菌的耐药菌株不断增多、耐药谱不断扩大，进而导致治疗效果下降，养殖效益降低，同时对食品安全构成威胁。噬菌体作为细菌的天敌，可以裂解宿主菌，其专一性强，不会感染畜禽机体，也不会产生耐药性。采用噬菌体治疗禽大肠杆菌病是一个新思路，

3、也是畜禽疾病研究的一个方向。本研究从某大型养鸡场采集粪便样品，分离、纯化、鉴定多株大肠杆菌，利用分离纯化的大肠杆菌为宿主菌，从粪便中分离对应噬菌体，并对其中一株噬菌体进行生物学特性的测定。用筛选到噬菌体的所有大肠杆菌菌株，通过饮水、腹腔注射等不同途径对鸡进行攻毒，建立和优化鸡大肠杆菌病动物模型。利用相应噬菌体通过口服、腹腔注射等不同方式对鸡大肠杆菌病进行治疗性试验，验证治疗效果，为鸡大肠杆菌噬菌体的临床应用提供依据。大肠杆菌的分离鉴定。从某大型养鸡场采集粪便样品，放入生理盐水中搅拌，上清经平板划线法依次在麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝培养基上进行分区划

4、线，并将得到的单个菌落在伊红美蓝培养基上进行纯化。然后，将纯化后的大肠杆菌经革兰氏染色、微量生化反应进一步鉴定。共从粪便中分离纯化20株大肠杆菌，所有菌株在麦康凯琼脂培养基呈红色或粉红色，在伊红美蓝培养基上呈暗紫色且带有绿色金属光泽；经革兰氏染色，光学显微镜下拍照观察，菌体呈红色、短杆状；采用细菌微量生化反应管对各菌株进行生化鉴定，显示各菌株为大肠杆菌。噬菌体的分离鉴定。以分离的20株大肠杆菌为宿主菌，采用双层琼脂平板法从粪便中分离噬菌体，结合液体增殖法将噬菌体进行纯化；采用点滴法对所分离噬菌体进行宿主交叉感染试验；将富集的Bp5、Bp6噬菌体用2

5、％磷钨酸进行负染，利用透射电镜观察噬菌体的形态。共分离到Bp1、Bp2、Bp3、Bp4、Bp5和Bp6等6株噬菌体，其对应的宿主菌暂命名为E1、E2、E3、E4、E5和E6，全部噬菌体分离株均可以在双层琼脂平板上形成外部形态规则、大小统一的噬菌斑；宿主交叉感染试验显示Bp1和Bp3i可以相互感染对方宿主菌；透射电镜结果显示，噬菌体Bp5和Bp6都没有明显的尾部，头部呈不规则多面体状，直径约50nm。噬菌体的生物学特性测定。采用双层琼脂平板法和平板计数法分别测定Bp1、Bp2、Bp3、Bp4、Bp5和Bp6等6株噬菌体的效价；测定噬菌体Bp5的温度稳

6、定性、pH稳定性、最佳感染复数和一步生长曲线等生物学特性。Bp1、Bp2、Bp3、Bp4、Bp5和Bp6141410141011的效价分别为2×10、1.65×10、1.9×10、4.5×10、2.4×10和1.35×10。Bp5在40~60℃温度范围内，在5~10PH范围内保持较高效价；Bp5最佳感染复数为1；一步生长曲线显示，Bp5潜伏期20min，裂解期50min，裂解量61.6。鸡大肠杆菌病动物模型的建立。分别用分离得到的大肠杆菌E1、E2、E3、E4、E5，E6和标准毒株（CVCC1568）通过口服攻毒、颈部皮下注射攻毒和腹腔注射攻毒三种

7、途8径（剂量为1.25×10cfu/只）进行建模，确定最佳建模菌株和最佳攻毒途径。结果：用大肠杆菌E5通过腹腔注射途径进行攻毒，试验组鸡出现心包炎、肝周炎和气囊炎等典型的大肠杆菌病症状，标准毒株（CVCC1568）腹腔注射致病效果不如E5致病效果明显，故选择E5作为大肠杆菌病动物模型建模菌株。噬菌体的治疗性试验。通过口服和腹腔注射噬菌体Bp5两种途径，分别在注射大肠杆菌E5前6h、前3h、0h、后3h和后6h不同时间进行治疗，验证治疗效果和治疗途径。口服噬菌体治疗试验中，注射大肠杆菌E5前3h和后6h的致病指数分别为12.5%和25%，与对照组62

8、.5%相比，噬菌体具有一定的预防和治疗作用；腹腔注射噬菌体治疗试验中，注射大肠杆菌E5前6h、前3h和0h组的致病指数全部