CKSHF98株H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备和CKSDC911株生物学特性及表面基因序列分析.pdf

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1、CK／SH／F／98株H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备和CK／SD／C9／11株生物学特性及表面基因序列分析PreparingthemonoclonalantibodiesofCK／SH／F／98(H9N2)andanalyzingthebiologicalcharacteristicsandthetwosurfacegeneofCK／SD／C9／11(H9N2)avianinfluenzavirus国家自然科学基金(31172300)江苏省高校自然科学研究重大项目(12KJA230002

2、)教育部创新团队基金(IRT0978)江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)研究生：李烨初专业：基础兽医学导师：石火英教授扬州大学兽医学院2013年5月H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及传播特性的研究fIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIlY2419624CK／SH／F／98株H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备和CK／SD／C9／11株生物学特性及表面基因序列分析摘要H9N2亚型禽流感病毒在我国广泛流行和传播，给我国的养禽业造成了严重的经济损失。1999年首次出现H9N2亚型

3、禽流感病毒感染人的报道。最近在我国部分省市出现了H7N9亚型禽流感病毒感染人并造成死亡的报道，该病毒可能是通过基因重排产生的新亚型禽流感病毒，因此禽流感病毒已对人类的健康和生命安全产生巨大的威胁。本论文研制了H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体，分析了单抗的特异性，并利用研制的单抗，通过免疫组织化学方法检测了SPF鸡感染H9N2亚型禽流感病毒后抗原在组织中的分布情况；本论文还探讨了新分离的一株H9N2亚型禽流感病毒的传播和复制特性，运用病理组织学和免疫组织化学方法对其进行了致病性方面的研究；同时对

4、其HA基因和NA基因进行了序列测定和遗传进化分析。为H9N2亚型禽流感病毒的快速诊断、抗原性分析和流行病学调查提供了有价值的技术资料。以我国流行的代表株A／Chicken／Shanghai／F／98(H9N2，简称F株)作为免疫原，通过差速离心法提纯后免疫8周龄BALB／c小鼠，利用杂交瘤技术，通过HI试验和间接ELISA试验筛选出阳性细胞孔，并经三次有限稀释法克隆，获得了1C10、6D7两株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。两株细胞培养上清和腹水HI效价分别为27一、2”。4，腹水ELI

5、SA效价均达到了5×104以上；特异性实验表明两株细胞培养上清与H5亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合症病毒无任何交叉反应，仅与H9亚型禽流感病毒发生凝集抑制反应，具有良好的特异性；Westernblotting分析显示两株单抗能与禽流感病毒75kd的蛋白发生特异性反应，表明了是针对H9亚型禽流感病毒HA蛋白的单抗；用F株尿囊液按10一EID50接种剂量攻毒4周龄SPF鸡，第5天将其剖杀，通过免疫组织化学方法，利用所制备的单抗检测到鸡肺脏中的H9亚型AIV抗原的分布。选

6、取在山东齐河县新分离得到的一株H9N2亚型禽流感病毒，命名为A／Chicken／Shandong／C9／201l，简称C9株，经测定c9株AIV的血凝效价为210‘11，EID50和ELD50分别为1011125／0．2mL、109／0．2mL，是很好的H9N2亚型禽流感病毒的疫苗候选株。但是该株的传播特性和复制特性还不清楚，因此本章对此进行了研究。将C9株AIV尿囊液按10一EID50剂量通过口服、滴鼻和点眼的方法对4周龄SPF鸡进行传播特性和致病性实验。对4周龄SPF鸡的传播特性实验发现，C

7、9株AIV主要在呼吸道复制，在消化系统也2扬州大学硕上学位论文分离到病毒；可以通过直接接触、气溶胶传播途径和粪便接触途径传播。显微观察C9株感染鸡只后各组织的病理组织学变化，发现病变主要集中在气管和肺脏中，但消化系统未出现明显的病变；利用所制备的单抗在鸡气管和肺脏中检测到了C9株AIV抗原。为从分子水平上了解C9株AIVHA基因和NA基因的变异情况，本论文第三章参照Genbank上己发表的H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因核苷酸序列设计出特异性扩增引物，利用RT-PCR的方法扩增出HA基因和N

8、A基因，进行克隆和测序。通过对C9株AIVHA基因和NA基因的核苷酸同源性序列分析和遗传进化分析，结果表明了c9株AIVHA基因和NA基因都来自于Y280．1ike亚系，与其代表株A／Duck／Hongkong／Y280／97(H9N2)核苷酸同源性分别为92．8％、93．6％；进一步推导发现，C9株AⅣ与A／Duck／Hongkong／Y280／97(H9N2)的HA基因和NA基因的氨基酸同源性分别达到了94．4％和95．3％，亲缘关系较近；但与人源流感病毒A仞列1073／99(H9N2)的H