拟南芥窄叶抗病突变体27.2基因的图位克隆与功能研究.pdf

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万方数据ShandongAgriculturalUniversityPh．D．DISSERTATIONMap—basedCloningandFunctionalAnalysisofanArabidopsisMutant27．2withNarrowLeafandDiseaseResistanceDepartment：PlantProtectionMajor：PlantPathologyPh．D．Candidate：WeiYangSupervisor：ProfessorXinhuaDing2014．06．07 万方数据关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：苎堑熙导师签名：丁亲彳挚日期：№』乒4-／／ 万方数据符号说明缩写符号英文名中文名cDNAcomplementaryDNA互补DNAETETIGCGFPHPLCHRICSlJALRRMeJANahGNONPRlPCDPDFl．2PRPTIethyleneEffector-triggeredimmunity乙烯效应子触发的免疫反应gaschromatography气相色谱greenfluorescentproteinlli曲performanceliquidchromatographyHypersensitiveresponseIsochorismatesynthase1JasmonicacidLeucine-richrepeatmethyljasmonateSalicylatehydroxylaseNitricoxide绿色荧光蛋白高效液相色谱超敏反应异分支酸合成酶1茉莉酸亮氨酸富集重复茉莉酸甲酯水杨酸羟化酶一氧化氮nonexpressorofpathogenesis-relatedgenes1病程相关基因非表达子1Programmedcelldeath细胞程序化死亡plantdefensin植物防卫素PathogenesisrelatedproteinPAMP-triggeredimmunityRNA·SeqRNAsequencingROSSASADSARSNPSSRreactiveoxygenspeciessalicylicacid病程相关蛋白PAMP触发的免疫反应转录组测序活性氧水杨酸Stearoyl．acylcarrierproteindesaturase硬脂酰酰基载体蛋白去饱和酶Systemicacquiredresistance系统获得性抗性singlenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性Simplesequencerepeat简单序列重复 万方数据目录摘要一⋯⋯⋯⋯一一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一一ABSTRACT刖舌～IIIIl植物抗性机制研究进展1．1拟南芥抗病基因的克隆1．2植物抗病基因的结构1．3抗病基因的分类一．3⋯4⋯)一13—15—161．4植物抗病信号分子及其网络2SSl2基因研究现状3蛋白互作研究技术进展3．1酵母双杂交3．2双分子荧光互补⋯一3．3Pull．down技术与免疫共沉淀4本研究的目的与意义．17第二章27．2突变体基因的图位克隆及功能鉴定1材料与方法17～19—191．1拟南芥材料及培养1．2菌株和载体1．3常用酶与生化试剂1．4常用仪器1．5溶液及培养基的配制1．6核酸操作及载体构建1．6．1DNA及RNA抽提．1920．．．．．．．．201．6．2RT-PCR和定量PCR分析1．6．3感受态细胞的制备1．6．4热激转化大肠杆菌(DH5a)20．．．．．．．．231．6．5电转化农杆菌感受态细胞(GV3101)1．6．6转化菌落的阳性鉴定2324 万方数据1．6．7质粒DNA的提取1．7拟南芥基因的克隆与转化⋯⋯⋯⋯一1．8病原菌ntDC3000接种和细菌生长分析1．9细胞学染色1．10拟南芥叶片脂肪酸测定2结果与分析⋯一⋯⋯⋯．．2．127．2突变体的鉴定2．227．2基因图位克隆2．327．2的表型介于野生型和T-DNA突变体之间2．427．2的去饱和酶活性降低2．5SSl2基因三个突变体的表达谱分析252627332．6qRT-PCR验证表达谱数据⋯一⋯⋯⋯⋯⋯·3讨论3．1SSl2基因功能的复杂性394346．．．．．．．．463．227．2(ssi2-1)突变体可能的应用优势⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．47第三章SSl2基因的互作蛋白及其功能研究1材料与方法1．1拟南芥材料及培养一⋯1．2菌株和载体．．1．3酵母双杂交一1．3．1载体的构建．．．．．．．．491．3．2文库的筛选⋯-二-⋯⋯⋯．1．3．3酵母体内互作验证．1．4双分子荧光互补实验1．4．1BiFC载体构建1．4．2双分子荧光互补(BiFC)1．5免疫共沉淀49501．6Western杂交分析一1．7病原菌风f．DC3000接种和细菌生长分析1．8拟南芥叶片脂肪酸测定⋯一⋯⋯⋯⋯．51 万方数据1．9拟南芥叶片碳酸酐酶活性测定2结果与分析．．．．．．522．1ssi2．．f不影响SSl2蛋白二聚体的形成2．2SSl2蛋白与CAl蛋白互作2．3SSl2突变体中CAl表达受到抑制2．4CAI基因是ssi2．J介导的抗性所必需2．5ssi2—1中CA活性降低2．6缺失CAl基因能够增强SSl2酶活性3讨论结论3．1SSl2基因可能参与多种生化途径3．2SSl2与CAl互作参与植物抗病的可能机制参考文献致谢一．附录I．附录II．附录III附录Ⅳ一⋯⋯—．8385868788弱舛"鼹钞∞们甜酊以斛 万方数据山东农业大学博士学位论文摘要植物抗病信号传导一直是分子植物病理学研究的热点，植物防御网络是一个非常精密复杂的系统，现在总结出植物中存在两大主要的抗病信号通路，分别是水杨酸和茉莉酸介导的信号途径。这两种激素是植物受到病原菌感染后产生的非常重要的信号分子，它们能够分别诱导产生系统获得性抗性(SAR)和诱导系统抗性(ISR)。这两条信号途径中的一些重要元件已经得以鉴定，但是其中仍有很多机制不甚明晰，还存在许多元件等待挖掘和鉴定。突变体筛选是经典的也是最常用的鉴定信号途径中新元件的方法。本研究从EMS化学诱变拟南芥野生型C01．0突变体库中筛选获得了一个突变体，命名为27．2。27．2具有叶片窄小而卷曲，且叶表面有坏死斑的表型。对突变体的抗性分析发现，该突变体叶片中H202和超氧化物的含量升高，可组成型表达抗病蛋白基因瞅J，并且对拟南芥病原细菌丁香假单胞杆菌(n，DaD∞)表现出抗性增强。利用图位克隆的方法从5000个单株的F2群体中克隆了该基因，序列比对发现27．2编码一个硬脂酰．ACP去饱和酶(AT2G43710)。有趣的是，我们在基因的编码区同时发现了两个G_÷A的点突变。功能互补实验验证了导入野生型基因片段可完全恢复上述突变表型。AT2G43710编码402个氨基酸，生化功能是催化硬脂酸(18：0)向油酸(18：1)的转化过程，它是植物合成不饱和脂肪酸的关键基因。AT2G43710此前己被发现与植物的抗病性有关，前人在筛选nprl的回复突变的突变体库中鉴定并克隆到了这个基因，并被命名为SSl2(suppressorofSAinsensitive2oAT2G43710基因的146位氨基酸的突变可造成SSI蛋白的酶活性降低，导致对内抗病性提高。但本研究发现的27．2突变位点以及表型与已经报道的ssi2不完全一致，因此我们将27．2突变体重新命名为ssi2．J。通过比较ssi2．J和ssi2，ssi2-2(T-DNA突变体)之间抗病性和酶活性等生理生化的指标，我们发现ssi2一J『无论是在抗病性还是在生长发育上的表型都是介于野生型和ssi2与T-DNA突变体之间。例如ssi2．J『、ssi2和ssi2．2突变体中艘|，基因相对于野生型均有提高，上调倍数ssi2．J为28．9倍，而ssi2，ssi2—2突变体中达到835．4倍和244．9倍。在酶活性方面ssi2一．，也符合这一特征，ssi2．J，ssi2突变体的叶片中油酸(18：1)的含量相比野生型均有下降，ssi2的含量约为野生型含量的1％，而ss／2一J中可以达到野生型的30％。这些结论都说明ssi2-1是SSl2基因的一个弱突变体。利用RNA．seq技术我们对C01．0，ssi2．J，ssi2，ssi2．2进行了分析。发现在SSl2的 万方数据拟南芥窄叶抗病突变体27．2基因的图位克隆与功能研究三个突变体中，有747个基因被共同上调。这些基因包括一些已经鉴定的与植物抗病反应相关的基因，如觥J基因，钙结合蛋白(calcium-bindingprotein)，MKK4基因(mitogen．activatedproteinkinase4)等等。另有892个基因被共同下调，这其中包括大量与光合作用，碳固定有关的基因，这也符合SSl2的三个突变体均表现出植株矮小这一特征。同时，RNA．seq数据进一步支持了ssi2．J『是SSl2基因的一个弱突变体的结论。后续研究发现ssi2．J中的点突变不影响SSl2蛋白自身互作，从而排除了ssi2．J通过影响SSl2二聚体的形成进而影响其酶活性的假设。利用酵母双杂交技术筛选拟南芥酵母双杂交文库得到了8个可能的SSl2互作蛋白，并对其中一个基因进行了深入研究。该基因编码B型碳酸酐酶(CarbonicAnhydrase，IB-CAl)，此前被发现参与植物抗病反应和SA信号转导。CAl与SSl2之间的互作分别通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验得到了证实。我们发现SSl2基因的三个突变体中CAl基因的表达都是被抑制的，说明SSl2可能参与调控CAl基因的表达。通过检测植物叶片总碳酸酐酶活性显示ssi2．J中CAl酶活性降低，而C01．0和ssi2中并没有这一现象，且ssi2一』突变不影响与CAl的互作，暗示SSl2能够直接通过蛋白互作影响CAl酶活。同时，我们发现cal突变体中的SSl2酶活性是上升的，ssi2一Jcal双突变体表现出对病原菌nfDC3000增强的感病性，与cal单突变体表型相一致，而叶片窄小的表型则与ssi2一J类似。由此，我们认为CAl与SSl2之间可能通过直接的蛋白互作相互影响酶活性而传递抗病的信号。CAl是ssi2．J抗病过程中所必需的，在这一过程中，SSl2可以正向调控CAl，而CAl负反馈SSl2，它们共同完成SSl2对植物感病性(或CAl对植物抗病性)的信号传导。关键词：抗病；叶型；硬脂酰-ACP去饱和酶；碳酸酐酶；蛋白质相互作用 万方数据山东农业大学博士学位论文Map-basedCloningandFunctionalAnalysisofanArabidopsisMutant27．2withNarrowLeafandDiseaseResistanceABSTRACTPlantdiseaseresistancesi印altransductionhasbeenahotspotinmolecularplantpathologyandplantdefensenetworkisaverysophisticatedsystem．Therearetwomainresistancesignalingpathwaysinplants，whicharesalicylicacid-mediatedandjasmonicacid-mediatedsignalingpathways．Thesetwohormonesareveryimportantsignalingmoleculesproducedbytheplantswhichsufferedpathogeninfection．Theywereabletoinducetheoccurrenceofsystemicacquiredresistance(SAR)andinducedsystemicresistance(ISR)，respectively．Someofimportantelementshavebeenidentifiedinthetwosignalingpathways，buttherearestillmanymechanismswhicharenotquiteclear,therearemanycomponentswaitingforidentification．Mutantsscreeningisaclassicandthemostcommonlyusefulmethodfortheidentificationofnewsignalingpathwaycomponents．ThroughconstructionofanArabidopsismutantlibraryviaEMSchemicalmutagenesis，weidentifiedthe27．2mutant．27．2displayednalTOWleavesandspontaneouslynecroticlesions．FurtherstudiesdemonstratedthatthemutantconstitutivelyexpressedPRgene(PRl，PR2，PR刃andthelevelofH202intheleavesincreased．27．2alsoenhancedresistancetobacterialpathogenPseudomonassyringaepv．tomatoDC3000．Weclonedthegenethroughmap—basedcloningstrategy,andfound27．2encodesastearoyl-ACPdesaturase(AT2G43710)bysequencealignment．Interestingly,wefoundtwoseperatedpointsubstitutioncausedtheaininoacidalternationinthegenecodingregion．Thefunctionalcomplementationexperimentsconfirmedthatthedoublemutationofthegenecouldindeedcausethephenotype．AT2G43710encoded402aminoacidswhosebiochemicalfunctioniscatalyzedstearicacid(18：0)tooleicacid(18：1)，itisacriticalgeneinsynthesisofunsaturatedfattyacidsinplant．AT2G43710isfoundtobeanelementoftheplantdiseaseresistance．ThepredecessorsidentifiedandclonedthisgenebyasuppressorscreeninthenprlgeneticbackgroundwhichwasnamedSSl2(suppressorofSAinsensitive2)．Thus，the27．2mutantwasrenamedssi2一J． 万方数据拟南芥窄叶抗病突变体27．2基因的图位克隆与功能研究Bycomparingthephenotypeofssi2一landssi2，ssi2—2(T-DNAmutant)，wefoundssi2一ldisplayedailintermediatephenotypebetweenthewild-typeandT-DNAmutantbomi11diseaseresistanceandinthegrowthanddevelopment，suchastheexpressionofPRlgene．ssi2·1，ssi2，ssi2-2mutantsconstitutivelyexpressedthePRlgene、andthetranscriptionallevelis28．9一foldinssi2一Jcomparedtothe谢ldtype，whilethessi2，ssi2—2mutantisreached835．4-foldand244．9一fold．111eresultofenzymeactivitydetectionalsocomplied、]l，itllthisrule．Theoleicacid(18：1)contentdeclinedinbothssi2andssi2一／mutantleaves，onlyreachedthelevelsof1％and30％ofthewildtype，respectively．Theseconclusionsconfirmedthatssi2．JiSaweakmutant．WeanalyzedtheexpressionlevelsofCol一0，ssi2一』，ssi2，ssi2—2(T-DNAmutant)usingRNA—seqtechnology．Thereare747genesareup—regulatedinallthreeSSl2mutants．Thesegenesincludedsomeplantdiseaseresistancegenes，suchasPRl，calciumbindingprotein(calcium-bindingprotein)，MKK4gene(mitogen-activatedproteinkinase4)．892genesweredown-regulatedtogether,whichincludesalargenumberofphotosynthesis，carbonseques仃ation-relatedgenes．andthisisconsistent、析t11thedwarfphenotypeofthreeSSl2mutants．Nextwefoundssi2-JmutationdoesnotaffecttheSSl2proteintoformdimers，therefore，weexcludedthehypothesisthatssi2—1affectedtheenzymeactivitybydisruptedtheformationofdimer．WescreenedtheimeractingproteinsofSSl2usingyeasttwo—hybridtechnology．WegoteightcandidatedSSl2interactingproteins，andoneofthesegenesWritsstudied．Thegeneencodedap-typecarbonicanhydrase(CarbonicAnhydrase．Z-CAl)．r-CAlWasregardedtoparticipateSAsignaltransductionpreviously．Tllisinteractionwasconfirmedbyyeasttwo—hybridandbimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)experiments．WefoundtheexpressionofCAlgeneisinhibitedinthethreeSSl2mutants，indicatedSSl2maybeinvolvedinregulationofCAlgeneexpression．TheCAlenzymeactivitydecreasedinssi2一Jbydetectingtotalcarbonicanhydraseactivityintheplantleaves，andCol一0andssi2mutantdidnotpossessthisphenomenon．Additional，thereisnodifferenceinthecapacityofSSl2andssi2—1proteininteractionwiththeCAl，theseresultsimpliedthepointmutationofssi2一Jmaybeassociated、析tllSSl2proteintoregulatetheactivityofCAl．AtthesametimewefindenzymeactivityofSSl2raisedincalmutant．111ephenotypeofssi2一JcaIdoubleIV 万方数据山东农业大学博士学位论文mutantissimilartoss／2．J，however,thedoublemutantissusceptiblebyPstDC3000infection,whichisdifferentfromthessi2-1．Thus，webelievethatthereisaresistancesignaltransduetionpathwaybyinteractionofCAlandSSl2whichinfluencetheenzymeactivitiesbyeachother．Inthisprocess，SSl2canpositivelyregulateCAl，andCAlnegativefeedbackSSl2，theycontrolleddiseaseresistanceoftheSSl2plant(orsusceptibilityofplantCAl)signalingtransduction．Keywords：Diseaseresistance；Leafshape；Stearoyl-ACPdesaturase；Carbonicanhydrase；ProteininteractionV 万方数据山东农业大学博士学位论文刖吾1植物抗性机制研究进展植物在整个生长周期中会遭受成千上万种病原微生物(细菌、真菌、病毒)和线虫的侵染，但仅有少数病原物能够击败植物防御系统，侵入植物体并引起病害。由于植物细胞拥有厚且坚硬的细胞壁来做为天然坚实的防御屏障，所以病原菌首先需要突破植物的细胞壁。它们可以通过植物天然的孔口，如打开的气孔，水孔：表面伤口以及直接渗透三种方式进入叶片表面(JonesandDangl，2006)。许多病原菌还可以分泌一些酶和化学物质来达到加速降解和破坏植物细胞壁的目的。做为响应，当植物细胞感受到病原菌的入侵时，会产生一些胼胝质和木质素，使植物细胞壁通过木质化和角质化来增加细胞壁的硬度和细胞群的机械力，从而达到加强细胞壁防御能力的目的(Glazebrook,2005；aruskyandLichter,2007)。与此同时植物能产生一些酶的抑制剂来保护细胞壁的组分不被病原菌分泌的酶降解，从而阻断病原菌进入植物细胞的通路(Juge，2006)。虽然拥有着坚固的细胞壁，但是病原菌仍然有机会攻克这层防线的保护而直接进入植物叶片表面。在病原菌成功进入植物叶片表面后，就开始了植物与病原菌之间新一轮的对抗。这一级防御包括植物体对不同种病原微生物中一些共同组分的识别，迄今为止所发现的病原菌相关分子模式PAMPs(Pathogen．associatedmolecularpatterns)有很多种类，如细菌病原菌丁香假单胞菌的鞭毛蛋白，脂多糖和EF．Tu(Cunhaeta1．，2012；Zhangeta1．，2012；ZhangandZhou,2010)。这些都是微生物非常重要的分子物质，并且具有高度保守和缓慢进化的共同特点。在病原菌识别受体监测到这些组分的同时，植物在非常短的时间内就迅速启动了一系列P—心伸触发的免疫系统机制，简称PTI(PAMP-lriggeredimmunity)(Zipfel，2009；SchwessingerandZipfel，2008；SegonzacandZipfel，2011)。包括启动病原菌免疫应答基因，ROS(活性氧)的产生以及细胞壁的加固等几个方面(BoilerandHe，2009；PostelandKemmerling,2009)。这一系列的应答响应都是为了减缓病原菌在植物体内的生长速度，从而有效的防御和控制病原菌对植物造成伤害(JonesandDangl，2006；Abramovitcheta1．，2006；Dong，2001)。植物通过感受器对PAMPs的识别而产生的一系列防御机制对病原菌的侵染起到了非常有效的防御作用。与此同时病原菌也需要进化出一些机制来抑制植物识别PAMPs时所触发的免疫反应。为了抑制这些PAMPs触发的免疫应答反应，病原菌利用其自身三型分泌系统T3SS(TypeIIIsecretionsystem)，将一些能够影响植物细胞的蛋白质注入 万方数据拟南芥窄叶抗病突变体27．2基因的图位克隆与功能研究植物细胞内(Collmereta1．，2000；Cheneta1．，2004；AbramovitchandMartin，2005)。这些效应蛋白或是毒性蛋白都会起到阻碍或是限制植物防御响应机制的作用。失去了T3SS功能的突变体细菌对植物的致病能力会明显减弱且不能很好在植物体内生长，这些都是因为它们失去了抑制PAMPs触发植物免疫的能力(JonesandDangl，2006；Abramovitcheta1．，2006)。为了对抗病原菌T3SS，植物会具备一些抑制和阻碍这些效应蛋白或毒性蛋白功能的机制。植物中的抗性蛋白(R蛋白)能够直接或是间接识别某种特定的病原菌效应物，并且引发效应物触发免疫，简称ETI(effector-tfiggeredimmunity)(HowdenandHuitema,2012；Nomuraeta1．，2011；ZhangandZhou，2010)。近些年，R基因在许多不同种类的植物中被发现并被用于提高植物抵抗病原菌入侵能力(Martineta1．，2003；Abramovitchelal，2006)。ETI机制包括与PTI一样的许多种不同的免疫应答反应以及超敏反应(HypersensitiveResponse，HR)。超敏反应是一种非常快速引起细胞程序性死亡的免疫应答过程，对限制病原菌在植物体内生长具有重要的意义(JonesandDangl，2006)。PTI途径和ETI途径同时也包含了许多相同的组分，拟南芥中一些信号组分同时被PTI和ETI所需要的事实充分证明了这一观点(Tsudaeta1．，2008；Wiermereta1．，2005；PostelandKemmerling，2009)。通常情况下植物可通过诱导产生的HR反应识别、抵抗病原物的侵染。HR反应利用侵染点及周围细胞与组织的死亡来抑制病原物的进一步侵染，并常常可使未受侵染部分和整个植物体产生系统获得抗性(Systemicacquiredresistance，SAR)，SAR的诱导因子包括不亲和病原物的入侵(R基因与Avr基因相互识别)、许多专性寄生病原物的侵染、各种生物与非生物激发子刺激。HR反应迅速从生化、生理及分子水平上抑制病原物的扩展，其中包括活性氧的爆发、跨膜离子流的变化、病程相关蛋白(Pathogenesis．relatedproteins，PR)、具有抗菌活性的次生代谢物质植保素及其合成酶类。植物内源激素水杨酸(salicylicacid，SA)介导SAR，主要针对专性寄生病原物，包括病毒、卵菌和真菌，以及从植物叶片侵染的病原细菌等(Volteta1．，2009)。除了系统获得性抗性外，诱导性系统抗性(Inducedsystemicresistance，ISR)也是植物抗病信号转导途径中的重要形式。与SAR不同的是，ISR是由促进植物生长的根系细菌(PGPR)在植物根系定殖诱导的抗病性，并不诱导PR合成。另外非常重要的一点是ISR需要茉莉酸／乙烯(Jasmonicacid／ethylene，JA／ET)作为信号分子，诱发JA及ET信号传导的因素，主要有创伤、某些环境胁迫(如臭氧毒害)、昆虫取食、从根系侵入的病原物(如十字花科植物根肿菌)的侵染、某些非病原细菌在根系的定殖等。JA及ET介导的抗病2 万方数据山东农业大学博士学位论文性主要抵抗从根系侵入的病原物和某些引起叶斑症状的兼性寄生病原真菌(Kooeta1．，2009；Ballar琶eta1．，2011)。SA和JA这两种信号分子的传导途径之问既相互独立又相互联系，协同作用，从而使植物作出合理有效的防卫反应。在植物抗病过程中，抗病信号从受侵染部位传导至整株植物，引发相应的系统性抗性，内源信号分子在植物抗病信号传导途径中起重要作用。目前研究比较透彻的植物内源信号分子包括水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)、过氧化氢(H202)和一氧化氮(nitrieoxide，NO)等小分子化合物。1．1拟南芥抗病基因的克隆拟南芥(Arabidopsisthaliana)是十字花科植物，因其具有独特的生物学优势而被植物学家广泛的应用于科学研究：个体小，大量的植株可以种植在一块很小的地方；生长周期快，6—8周即可以完成一轮生长周期；栽培管理简单，植物仅需要光、水和间或的施肥；自花授粉，有利于杂种后代的配制；遗传转化方法简单且植株可产生大量的种子，方便筛选转基因后代；野生生态类型多，能够提供丰富的表型变异的基因分析材料；只有5条染色体，基因组小(约150Mb)，基因组为2倍体，易于观察等位基因的显性和隐性性状；容易进行诱变，产生丰富的遗传变异(Meyerowitz，1989；Kunkel,1996；CloughandBent，1998)。到目前为止人们已经克隆了为数不少的植物抗病基因，其中大多数是从拟南芥中克隆得到的。鉴定植物抗性基因最常用的方法是利用植物的自然变异或对植物进行人工化学诱变和物理诱变，然后分析突变体的参与抗病的遗传学及分子生物学机理。90年代以拟南芥为材料克隆得到了拟南芥第一个抗病基因RPS2(Kunkeleta1．，1993；Benteta1．，1994)，从而将拟南芥研究拓展到了分子病理学领域。自此以后，植物病理学家利用拟南芥的各种生态型和突变体鉴定了许多新的抗病基因位点。例如对携带无毒基因AvrRpt的丁香假单胞菌Pseudomonassyringae产生抗性的RPS2(Mindrinosetal．，1994)，RPMl(Grantetal．，1995)，RPS4(Gassmannetal．，1999)和RPS5(Warrenet口，．，1998)等以及对野油菜黄单胞杆菌Xanthomonascampestris具有抗性的RXCl基因(Buelleta1．，1997)。1．2植物抗病基因的结构抗病基因是植物与病原菌相互作用的关键因子，是抗病机制研究的基础。抗病基因的克隆将有助于揭示寄主与病原菌相互作用的分子机理，推动植物分子病理学的发展。因此，对抗病基因的分离与分析成为当今抗病机理研究的热门课题，并己取得了显著的 万方数据拟南芥窄叶抗病突变体27．2基因的图位克隆与功能研究进展。植物抗病基因产物可能有两个功能：识别无毒基因和相应抗病基因的衍生信号；激活下游信号传导，引发植物的防御反应。目前从各种粮食、经济作物和模式植物中至少分离出70多个抗病基因(LiuetaL，2007)，通过对克隆的R基因的结构分析比较发现多数R基因具有序列的保守性，来源不同的R基因也可能存在一些共同的模体(motifs)(DanglandJones，2001；Hammond．Kosackandparker，2003)，如跨膜结构域(Transmembranedomain，TM)，亮氨酸拉链(Leueinezipper,LZ)，富含亮氨酸重复序列(Leueinerichrepeat,LRR)，核苷酸结合位点(Nueleotidebindingsite，NBS)，丝氨酸／苏氨酸激酶(Ser／Thrkinase，STK)，以及果蝇Toll蛋白和哺乳动物白细胞介素．1受体同源域(Tollandinterleukin-1receptor,T1R)等。1．3抗病基因的分类根据已经克隆的抗病基因的结构特点，已经克隆的R基因大致可以分为八类(Gururanieta1．，2012)，分类的主要依据是这些基因编码的氨基酸基序的相似性以及它们的跨膜结构域：第一大类为CC-NBS．LRR(nucleotidebindingsite，NBS；leucine-richrepeat。LRR)类R基因，它们通常位于细胞质内，近N端处存在着核苷酸结合位点(NBS)，近C端则存在着富含亮氨酸的重复序列(U汛)，该类抗病基因N末端具有一个CC结构域，例如拟南芥抗丁香假单胞菌的基因RPS2、RPMl基因等；第二大类为TIP,(tollandintedeukinreceptor)-NBS．LRR类。其N末端以一个TIR结构替换了CC结构，目前这类基因仅见于双子叶植物，烟草的N基因，亚麻的三6基因和拟南芥的RPP5是这类基因的代表；第三类LRR-TM类R基因的基因产物锚定于细胞膜上，包括三个区域：LRR结构域，跨膜区域和胞内结构域，包括番茄抗叶霉病基因，如cf2、cf4、cf-5和cf-9，它们的编码产物具有短胞质羧基末端(shortcytoplasmicCterminus，sCT)。第四类为LRR-RLK(Receptor-likekinase)类R基因，如水稻抗白叶枯病基因Xa21和Xa3／Xa26编码的蛋白均是此类受体蛋白激酶，它们的产物含有胞外LRR结构域、跨膜区域(Transmembranedomain,TM)和胞质内的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶区。第五类包括番茄Vel和Ve2基因，它们的编码产物具有内吞信号肽(Endocytosissignal，ECS)。另外，Vel产物的氨基端带有CC域，阮2的产物在羧基端带有PEST基序(Pro．Glu-Ser-Thr-likesequence，PEST)。拟南芥抗白粉病基因RPW8是第六大类抗病基因的代表，这类基因包含一个膜蛋白结构域和一个假定的CC结构域。第七类基因包括拟南芥抗青枯菌基因RRSl。这是一类新的TIR-NBS．LRR基因，这种蛋白质在C端携带核定位序列(NLS)和类似植物WRKY类转录因子的结构。WRKY结构域由60个4 万方数据山东农业大学博士学位论文氨基酸组成，其中含有一个保守的氨基酸序列WRKYGQK。第八类基因既不含有LRR结构也不具备NBS结构，例如对玉米提供对玉米圆斑病抗性的基因Hml。1．4植物抗病信号分子及其网络1．4．1水杨酸及其信号分子作用水杨酸(SA)是植物体内普遍存在的一种小分子酚类物质，化学名称为邻羟基苯甲酸。SA具有多种生理调节功能，如诱导种子萌劣邑果实成熟，以及植物对病毒，真菌及细菌等病原物的抗性(Vlot酣a1．，2012)。SA在植物的抗病过程中扮演了重要的角色，包括侵染部位局部抗性反应的激活和SAP,。当专性寄生病原物侵染植物时局部组织时，SA所介导的信号传导可帮助植物激活SAP,抗性。SA在诱导植物对病原菌的抗性中是一个重要的信号分子和调节分子(Shah，2003)。在植物体存在游离态SA和结合态SA(SAG)两种形式。早期的研究指出，植物体中水杨酸的大量积累可以使PR基因的表达量大幅增加，从而使植物抵御病原菌侵染的能力得到很大提高，且这种积累会同时出现在被病原菌入侵的植物组织以及远离被入侵部位的植物体其它组织中(Malamyeta1．，1990；M6trauxeta1．，1990；vanLooneta1．，2006)。更进一步的研究表明使用外源性水杨酸或者是水杨酸的类似物INA和BTH都可诱导PR基因的表达量上升，这一系列的证据都说明水杨酸在植物系统获得性免疫过程中起到了非常重要的作用(Wardeta1．，1991；Friedrieheta1．，1996；GorlaehetaL，1996；Lawtoneta1．，1996；Wangeta1．，2007)。SA在植物体内的合成由两条截然不同的途径完成。其一是由苯丙氨酸通过一系列中间体或香豆酸酶促反应而成，最初的催化反应起始于苯丙氨酸解氨酶。另外一条则是通过异分支酸在两步过程后转化为SA。涉及到的酶包括异分支酸合酶(ICS)和异分支酸丙酮酸裂解酶(IPL)(图1)。通常认为拟南芥在防御反应发生的过程中，水杨酸的合成更倾向于后一条途径。拟南芥编码两个ICS酶，其中ICSl／SID2定位于植物细胞的叶绿体中。在病原诱导或紫外诱导植物产生SA的过程中，大约90％的产量都是通过ICSl／SID2合成，除了ICSl／SID2之外，拟南芥基因组还编码ICS2酶，在icslics2双突变体中能积累的SA的水平仅有野生型的4％，说明ICS2也参与了水杨酸的生物合成过程。SAG在植物中的合成是由病原体诱导型SA-葡糖基转移酶(SAGT)催化的。拟南芥编码两个SAGT酶，其中一个起主要作用，另一个则负责合成一种低丰度的SA衍生物～水杨酰葡萄糖酯(SGE)。MeSA和／或它的糖基衍生物MeSAG在植物体内也有相当高的积累量(图1)。MeSA主要由一种SA结合蛋白⋯SABP2负责合成。SABP2 万方数据拟南芥窄叶抗病突变体27．2基因的图位克隆与功能研究编码一种酯酶，并且在植物SAR的过程中扮演重要角色(Forouhareta1．，2005)。Phen海lanine．I⋯‘‘Chor'mmmeIPALl焰CinnamicacidtsochofismeteOO