水稻叶片早衰基因osled的图位克隆及其功能研究

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pn；：硕士学位论文中文论文题目水稻叶片早衰基因的图位克隆及其功能研究英文论文题目作者姓名■晨指导教师潘刚副教授学科专业作物学所在学院农业与生物技术学院提交日期年月丨日 MasterDissertatrionMap-basedcloningandfunctionanalysisofaleafearlysenescencegeneOsLEDinriceMastercandidate:ChenChenZHAOSupervisor:AssociateProfessorGangPANInstituteofCropScienceCollegeofAgriculture&BiotechnologyZhejiangUniversity,Hangzhou,ChinaJanuary15,2015 水稻叶片早衰基因的图位克隆及其功能研究论文作者签名指导教师签名论文评阅人评阅人评阅人答辩委员会主席：周伟军教授委员委员程方民教授委员：潘刚副教撥答辩日期：年月日 大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：泰签字日期：。丨年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：。碑月《日签字日期年月日 本研宄受国家自然科学基金项目、资助、 致谢伴随着这篇论文的完成，我也将为我的硕士研究生生活画上句号。近三年来，我得到了充分的历练。即将离别之际，虽然我心中充满了不舍，但更多的则是感激之情。感谢潘刚老师对我毕业论文的精心指导。从论文的选题、实验的设计与实施及论文的撰写等方面，导师都倾注了大量的精力和心血。年月，我被浙江大学农业与生物技术学院录取，怀揣着对浙大的憧憬以及对学业的渴望，踏进了杭州这片土地接受硕士研究生教育。我学业的完成，离不开众多人的关心和帮助。在课题上，非常感谢张春娇师姐将自己所学全部教会于我；感谢毛节景师兄在我实验遇到困难之时对我及时的点播；感谢孙慧敏师姐教会我基本的实验技能；特别感谢龚盼师妹、杨茜师妹、黎坤瑜师弟在实验上给予我大量的无私帮助。在研究的过程当中我也很荣幸地得到了甘银波教授、徐建红教授、程方民教授以及博士等的帮助，也要感谢王宁师兄、万欢师兄、单武年师兄、秦国臣师兄、丛阅喜师兄、姜玉晓师兄、杜雪师姐、孙英超师兄、王安可师姐、潘晶晶师姐和李明天师兄等；感谢寝室室友耿威、尚钦之和易家，以及学习室成员李书霞、闰君、陆智辉等在生活上的关心和照顾。感谢父母对于我学业的支持，尤其感谢妻子赵霄霄对我的理解和帮助！使我顺利完成了学业。最后，在论文完成之际，向所有帮助过我的人表示衷心的感谢！赵晨晨年月 摘要水稻是中国乃至世界的重要主食之一，粮食产量尤其是水稻的产量将直接关系到我国粮食安全。叶片是水稻进行光合作用的重要器宫，其功能叶片的发育不良或提前衰老直接影响水稻产量及食用价值。研究水稻叶片早衰的分子机理，对了解水稻叶片生长发育规律及其衰老进程等方面具有重要意义，也将为分子育种奠定一定的理论基础。本课题组利用辐射诱变籼稻品种，获得了一个叶片早衰及干旱敏感的隐性突变体。本研究利用图位克隆技术及其他相关分子、生理及细胞学手段对进行了初步研究，主要结果如下：突变体的主要农艺性状与抗旱性调查在田间，突变体自分蘖期约片叶龄时后除心叶及心叶下部的片完整展开叶外，其他叶片均出现不同程度早衰。与野生型相比，突变体表现为生育期更长，植株变矮，穗粒数、千粒重、结实率均显著降低。摸拟干旱和自然条件下干旱实验表明，突变体对干旱胁迫更敏感。突变体的主要生理生化分析与组织化学染色生理分析表明，野生型剑叶、倒二叶和倒三叶的丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及过氧化物酶活性基本不变，但突变体则显著升高且倒二叶和倒三叶极显著高于野生型；突变体和野生型三片叶的可溶性蛋白含量、过氧化氢酶活性及叶绿素总含量均依次下降，但突变体倒二叶和倒三叶的含量或活性均显著低于野生型。组织化学染色表明，叶片细胞膜系统巳不完整或细胞死亡；细胞内存在和的积累。响应生长调节剂调控突变体植株生长研究表明，、和抑制突变体也植株生长发育。经处理之后，根长下降株高下降经处理之后，根长下降，株高下降。经处理，株高下降；处理之后，株高下降双氧水处理之后，株高下降。 4.自然生长条件下叶片的扫描电镜和激素处理后扫描电镜分析与野生型相比，扫描电镜结果显示突变体叶片刺毛极显著增多。表现在大刺毛（小刺毛（密度增加，数量增多。多效唾极显著抑制叶片上表皮刺毛发育；经处理后，叶片上表皮大剌毛（数量降低，小刺毛（数量增高而经处理的植株，叶片上表皮大刺毛和小剌毛的数量均显著增加。的基因定位及候选基因的确定突变体受到一个隐性基因调控，利用图位克隆技术将该基因定位在水稻第三染色体长臂上物理范围内。候选基因的筛选及基因组测序发现，位于该区间内的一个注释基因相关基因）发生两个碱基（缺失，造成移码突变。对定位群体中的正常植株与早衰植株进行重测序，比对结果进一步证实该基因发生突变。转基因植株的表型分析本课题组构建了载体和互补载体〇，经过遗传转化实验，获得了相应的转基因株系。与突变体相比，转基因植株衰老出现更早，在两叶一心期时即出现衰老。与突变体相比，互补的转基因植株表现正常，未出现衰老表型。关键词：水稻，早衰突变体，表皮毛，激素，基因克隆，基因功能 AbstractRiceisoneofthemostimportantcerealsintheworld,andmorethanhalfpeoplearoundtheworldfeedonit.ForChina,grainoutputespeciallyriceyieldissoimportantthatevenaffectsChinesefoodsecurity.Forriceplants,leavesaremainorgansforphotosynthesis.Presenescedandpoor-developedriceleaveswouldleadtolowsettingpercentageandweakcerealquality,whichdirectlydecidescropyieldanddeiblevalue.Studyingmolecularmechanismsofriceleafsenescencewouldnotonlymakesensetohelpusunderstandtheprocessofplantdevelopment,regulation,andsenescence,butalsooffershintsformolecularbreeding.Inourlab,aleafearlysenescencemutantosledfromRiceVariety9311wasobtainedby60Co丫，， Histochemicalstainingrepresentedanincompletesystemofmembraneorcelldeath,O2andH2O2wereseriouslyaccumulated.3,0sLEDresponsestophytohormonestoregulateplantdevelopmentResultssuggestthatgrowthofmutantosledwereseriouslyrestrainedaftertreatmentwithplanthormones.Plantheightandrootlengthofmutantosledweredecreasedandwereobviouslyshorterthanwildtype.Aftertreatmentwith1.5mMSA，，， OsLED-RNAitransgenicriceplantssenescedearliereventhanosledmutantBesides,wehavealsoclonedpCBOO-OsLEDandtransferreditintoosledmutantplantstoobservewhetheritcanrescuemutantphenotype.ResultsshowthatpClSOO-OsLEDtransgenicplantsdidn'tshowsenescencephenotypewhileosledmutantplantssenescedseriously.Keywords： 缩略词缩略词英文全称中文名称丙二醛超氧化物歧化酶过氧化物酶过氧化氢酶茉莉酸水杨酸氮蓝四唑染色）二氨基联苯胺染色）脱落酸细胞程序性死亡抗坏血酸谷脱甘狀赤霉素生长素细胞分裂素抗坏血酸过氧化物酶扫描电镜透射电镜简单重复序列 致谢鮮糾文献综述植物叶片衰老概述植物叶片衰老机制自由基损伤假说激素失衡假说基因调控假说影响植物衰老的非生物因素和生物因素植物衰老过程中的主要生理生化变化叶片衰老的启动叶片衰老的形成叶片衰老的终止水稻叶片衰老的研究进展激素影响水稻叶片衰老的相关研究自由基影响水稻叶片衰老的相关研究外界非生物因素影响水稻叶片衰老的相关研究病虫害影响水稻叶片衰老的相关研究水稻叶片衰老相关基因的研究影响水稻叶片衰老的其他因素本研究的目的及意义材料与方法实验材料与田间种植水稻幼苗的干旱胁迫处理模拟干旱胁迫自然干旱胁迫 2.3叶绿素含量测定活性、活性和活性的测定组织化学染色可溶性蛋白含量测定含量测定叶片扫描电镜观察叶片透射电镜观察和激素处理和提取标记分析遗传图谱构建候选基因的选择与测序遗传转化载体的构建水稻的遗传转化转基因植株表型鉴定转基因植株扫描电镜结果与分析的表型和主要农艺性状渗透胁迫下的耐旱性叶绿素含量分析抗氧化酶、和活性分析组织化学染色分析可溶性蛋白分析及含量分析突变体与野生型叶片扫描电镜分析突变体与野生型叶片透射电镜分析和对突变体和的生长发育的影响对突变体和的生长发育的影响不同激素对突变体与野生型叶片表皮毛的形成与生长的影响转基因植株的表型分析 3.13OsLED-RNAi转基因植株扫描电镜结果分析遗传分析及候选基因测序及序列比对分析主要结论参考文献 1.文献综述衰老是受内外因素调控的程序性细胞死亡（过程，也是植物生长发育的必经阶段。叶片是作物光合作用的主要场所，叶片的衰老直接造成光合作用减弱，这不仅影响作物的最终产量，还影响其品质。据统计，世界范围内由生物胁迫和非生物胁迫等外因引起的作物早衰，每年导致粮食产量下降左右。因此，研究作物叶片衰老的分子生理机理，对延缓作物叶片衰老的进程及改善作物的品质等方面具有重要的理论与实际意义。植物叶片衰老概述衰老是植物在繁衍中不断进化的结果，同时也是其适应环境的表现。自然情况下，叶片衰老过程中通常伴随着碳水化合物的重组及其向嫩叶或种子的转运，对植物繁衍后代意义重大。然而叶片衰老是植物生长发育的必然过程，即使外界营养条件充足且没有任何胁迫，衰老依然发生，。一般而言，植物正常生长时受到外界环境胁迫或者相关生理信号调控时，衰老是可逆的；但当植物进入成熟阶段，衰老则是不可逆的（，。植物生长发育后期的叶片衰老过程受到复杂的内外因素共同调控内因主要为内源激素及相关基因的精细调控；外因包括温度、光照、干旱、濟害等非生物因素及病虫害等生物因素丨《￡。叶片衰老的外在直接表现是叶色由绿变黄并最终枯死；而内在表现则是叶绿体降解、光合作用下降、蛋白质水解强度增大以及蛋白功能破坏等（《，。同时由于植物细胞内活性氧清除系统清除功能的条乱，导致植株体内大量的活性氧和自由基累积，从而产生大量丙二酸（，造成膜脂中脂肪酸链氧化及进一步破坏细胞中结构蛋白，加速了叶片衰老。植物叶片衰老机制多年来，科学家试图从理论上解释叶片衰老的机制并提出了多种植物衰老假 说，诸如自由基损伤假说、激素平衡理论以及基因调控假说等。这些理论假说从不同方面解析了叶片衰老的起始、经过以及终止，为完善叶片衰老的分子生理机理奠定了理论基础。自由基损伤假说在吁片衰老的众多假说中，自由基损伤假说一直被广泛认可。植物细胞内的自由基是正常生命代谢活动中重要的反应因素，但因自由基含有自由电子而使其具有高度的反应活性，当其浓度过高时会引发细胞内脂类和蛋白质的分子功能紊乱、酶活性降低、细胞膜功能紊乱以及分子结构破坏等，最终导致植物衰老。然而在植物细胞内存在众多的自由基清除酶（如、和等）和抗氧化剂（和等）（高小丽等，，这些保护酶和抗氧化剂能及时消除细胞内积累的自由基，使其维持在相对较低浓度。当植物衰老时，细胞内自由基的产生和清除之间平衡被打破，自由基大量积累并造成细胞毒害，导致细胞膜系统受损或瓦解，引起植物衰老孙长明，。激素失衡假说激素是植物生长过程中重要的生长调节物质，不同的生长发育期需要特定的激素辅助完成各项生命活动。研究表明细胞分裂素、赤霉素以及生长素等能够延缓叶片衰老；而脱落酸、乙稀、茉莉酸和水杨酸等则促进果实成熟，加速叶片衰老。细胞分裂素又称为激动素，可以降低衰老植株体内活性氧清除酶的降解速度，保护膜结构，减少积累陈杭芳等，。外施激动素可以抑制蛋白质和叶绿素的降解，延缓叶片衰老（，，且细胞分裂素类似物质同样可以延缓叶片衰老郭振飞等，杨远庆等，。目前，利用基因工程技术研究细胞分裂素合成酶基因延缓植物衰老的机理巳成为该领域的重要研究方面陈杭芳等，。在生产实际中，赤霉素能延缓多种植物的叶片衰老，因而常用于蔬菜和果品等农副产品的长途运输保绿（，。研究表明外施可以延缓杂交水稻叶片早衰（曾富华等，。生长素是植株内基本的激素，赵春江等 (2000)研究表明，生长素在小麦功能期和后期衰老叶片中含量较高，具有保持叶片生长发育，延缓衰老的作用。刘洪展等（研究也表明，适宜浓度的外源可以延缓海水胁迫造成的叶片衰老。大量研究表明，植物内源脱落酸的积累和外源脱落酸的施用都会促进叶片衰老李付振，，脱落酸甚至可以和细胞分裂素互作，启动叶片衰老进程。在生产实践中，乙稀是最常见的催熟剂。有研究表明，外施乙稀促进吁片衰老，外施乙稀抑制剂则延缓植物衰老（，但是乙稀并不直接促进植物衰老，而是作为信号调节因子调控植物衰老进程（。茉莉酸（是脂肪酸的衍生物，等（从大麦叶片中分离出茉莉酸甲醋，发现该激素能促进叶绿素的降解。另有研究表明，茉莉酸能够在转录水平激活，的表达，从而促进叶片衰老（。此外，等通过研究信号途径表明，水杨酸参与诱导并调节衰老相关基因的表迖，影响植物衰老；也有研究表明，水杨酸通过和其他激素互作，参与干單引起的植物叶片衰老（。植物衰老过程伴随着多种激素的共同作用，内源激素始终是衡量植物叶片衰老的重要指标，因此以内源激素含量为指标辅助育种具有重要意义。基因调控假说叶片衰老过程中，依据衰老期间的变化将衰老相关基因划分为衰老下调基因和衰老上调基因。叶片衰老过程中，与光合作用有关的蛋白质、叶绿素、，二碟酸核酮糖幾化酶加氧酶大亚基和小亚基等基因的转录丰度随叶片衰老而下降（，；而另一些基因如，和等则仅在叶片衰老是才能被检测到；除此之外，另有一些与衰老相关基因在植物生长初期即可检测到低水平表达，当植物衰老后表达量迅速上升，如，幼叶中即存在表迗，但在成熟叶片中表达不明显，而在衰老叶片中表达量又显著增加（。这说明，植物体内存在由多个调控途径组成的级联反应调节网，一些基因可能被某一个衰老途径调节，而另一些特定基因则可能只能被特定的衰老调控途径调控。 13影响植物衰老的非生物因素和生物因素光是调控植物衰老的重要条件，射线会诱发细胞内自由基积累，引其衰老。研究表明日照长度可以影响赤霉素和脱落酸的相对含量，长日照促进生成，抑制植物衰老；短日照促进生成，加速植物衰老。另外，光源也会影响叶片衰老，红光和蓝光可以抑制叶绿素和蛋白质降解，延缓衰老；但远红光作用则相反。干旱胁迫会促进植株体内脱落酸含量增加，加速蛋白质和叶绿素降解，加速自由基累积，造成植物衰老武维华等，。扩质营养尤其是氦素是植物生长发育的重要元素，缺氮会导致叶绿素合成受阻而导致早衰。在植株生长后期适当使用氮肥，可以延缓衰老勾玲等。此外，各种生物因素也会影响植物生长发育。病原菌或昆虫可以直接或间接破坏植物细胞结构，造成生理功能紊乱，导致光合作用下降，加速叶片衰老。土壤微生物可以改变碟元素的化学态，帮助植物吸收更多的碟元素延缓植物衰老。等（报道了一些氧化梳细菌能使单质疏变成，降低土壤值，促进双低油菜幼苗吸收矿质营养元素，如、和等。等（研究显示微生物可产生细胞分裂素，促进植物根的伸长，进而延缓植物衰老。植物衰老过程中的主要生理生化变化植物衰老是一种自发的物质降解过程，最直观的现象是器官颜色的变化，如叶片由绿变黄。然而，在衰老表型出现之前，植株体内早已出现了一系列生理生化变化，如蛋白质、核酸、叶绿素和脂类等大分子物质降解，细胞膜结构破坏以及细胞功能丧失等。等（将植物衰老分成三个阶段，分别是起始、衰退和终止。叶片衰老的启动植物衰老起始是由转导信号引起的，环境条件和植物激素等均可以作为相应信号。当然，糖作为植物光合作用的主要产物，也是诱导植株衰老的重要信号因子。己糖激酶不仅能够参与糖信号转导，同时也可以作为感受因子参与己糖碟酸 化的分解代谢活动，诱导叶片衰老；然而，自然生长条件下，糖水平是如何影响植物衰老的还不为所知。前人研究认为库源之间的能量分配，影响了植物体内糖类的积累，诱发了衰老。老叶作为源持续不断地向幼叶输送糖类。当幼叶不断发育形成完整光合系统时，能够独立积累糖类，这会引起老叶中糖累积，诱发老叶衰老，当然也有研究表明，糖的衰老调控也受氮素、光照以及发育阶段等因素影响。叶片衰老的形成衰老启动后，衰老就开始，衰老的整个过程伴随着细胞内营养物质的降解和再分配。叶绿体受核基因调控最先遭到降解，在叶片衰老早期，叶绿体形态变小、基粒数量变少及光利用效率急剧降低。徐竹生（研究水稻衰老外片叶绿素动态变化的结果表明，随着叶片衰老进行，叶绿素含量逐渐减少。同时，蛋白质和核酸的合成受到抑制，蛋白水解酶活性增加，。蛋白质作为植物体内的重要生命物质，其合成和降解保持平衡才能维持细胞正常生命活动。当植物衰老时，蛋白质的降解速度大于合成速度，因此在衰老植株体内蛋白质含量水平一般较低吴光南等，，大量蛋白质遭降解成小片段多肽或者氨基酸并进一步被转运到其他器官再利用当然，蛋白质的降解依赖于蛋白水解酶活性的提高，如泛素介导的水解反应。研究显示，泛素不仅参与了叶片细胞内蛋白质的直接降解，也参与了叶片衰老的调节，泛素类基因上调表达也造成与其耦合的基因表达增多，剌激并增强了蛋白水解反应。等（和等（研究表明可能作为连接酶介导蛋白质降解，调控叶片衰老。拟南苏中编码精氨酸转移酶，该酶参与蛋白质水解途径，把精氨酸转移至谷氣酸和天冬氨酸残基处，乾定特定蛋白进行水解，当该基因缺失时，拟南界早衰（。尽管依赖于泛素的蛋白质降解在叶片衰老过程中起着重要调节作用，然而在叶绿体蛋白降解过程中并不存在依赖于泛素的蛋白质降解系统，因此有人猜测，在叶绿体外可能存在调控因子，该因子能够引发信号传导级联反应，负向调控叶绿体蛋白质降解。 此外，无论是黑暗诱导的植物衰老，还是因为植物自身叶龄引起的衰老，植物细胞内都会出现大量核酸物质的降解，。研究表明，叶片衰老过程中，和水平均下降。大分子结构遭到破坏，解链后降解且在核酸降解中速度快于。叶片衰老过程中，也伴随着脂类降解，。等研究表明，在植物自然衰老中，脂类的降解在衰老过程中起到重要调节作用。也有研究表明，拟南界中脂类的降解可以推动吁片的衰老进程，；，。伴随着衰老，植株体内蛋白质和核酸、脂类等大分子水平下降，无法维持细胞内正常生命生理活动，植株衰老愈发严重。叶片衰老的终止植物衰老进入末期时，叶片完全变黄，甚至出现枯萎，此时仍可以检测到碎片，这些特征表明叶片衰老是一个程序性死亡过程一些对植物生长发育起到重要调控作用的基因缺失，也会引起植物自发的程序性死亡事件，并表现过敏性死亡表型，。水稻叶片衰老的研究进展水稻叶片衰老既受内因的影响也受外因的影响。内因主要包括水稻内源激素及衰老相关基因；外因主要包括各种非生物因素（如光照、温度、水分和外源激素等）及病虫害等生物因素。激素影响水稻叶片衰老的相关研究细胞分裂素能够抑制核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶和水解酶等活性，延缓核酸、蛋白质和十绿体等的降解并促使营养物质向幼嫩部位转移，从而延缓叶片衰老。研究表明，由衰老诱导的表达启动子可以使转基因植株在叶片衰老开始进行时表达，在一定程度上延缓了衰老还可以通过调节叶片作为源器官和库器官转换的过程调控叶片衰老（丨丨￡丨，也有研究表明外施可以一定程度上延缓水稻衰老以及外施赤霉素也可以提高水稻剑叶光合速率，延缓叶片衰老，增加水稻穗长，提高 水稻产量郑乐姬等，王嘉宇等，。大量研究证实茉莉酸可以诱发植物衰老，因此称其为死亡激素。等对水稻一个型锌指蛋白基因进行研究，发现该基因是信号通路上的信号因子，将该基因超表达时会抑制信号通路，延缓叶片衰老；当该基因表达受到抑制时，信号通路被激活，加速叶片衰老，这个结果直接证实了在水稻中可以促进口十片衰老。乙稀是叶片衰老的正向调节因子，但单独使用乙稀并不能引发衰老，还要有其他因子，如刀基因参与，乙稀可以加速离体水稻叶片叶绿素降解速度，促进叶片衰老（。脱落酸可以改变细胞膜的结构，不论是环境胁迫诱导积累或者外旅都会加速植株衰老魏道智，李付振，孙长明，。等（研究表明，对水稻外源施用可以提高水稻植株叶片内的含量，降低抗氧化剂含量，提高细胞内含量，促进水稻衰老，等（研究也表明，脱落酸诱导积累，加速水稻叶片衰老自由基影响水稻叶片衰老的相关研究自由基是引起植物衰老的原因之一。自由基一般为超氧阴离子自由基（经自由基（，过氧化氢（以及过氧化物（，在植株内正常生命代谢活动中产生。自由基会损坏细胞膜，造成膜脂过氧化，破坏结构，抑制蛋白质的合成，严重影响植物细胞结构。实际上，在植物体内存在清除这些自由基的多种保护酶，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等，这些保护酶段咏新，参与并形成多种清除活性氧途径。研究表明，水稻植株细胞内自由基的产生和清除之间存在平衡，这种平衡能有效防止膜脂过氧化，抑制水稻叶片衰老，维持植株正常的生长和发育杨激慎，高小丽，。外界非生物因素影响水稻叶片衰老的相关研究外界非生物因素如光照、温度、干旱和诱害等也是影响植物叶片细胞程序性死亡的重要因素，：王亚琴等，。研究表明，这些不利因素通常会引起植物体内活性氧累积，保护酶清除系统活力下降， 自由基的产生和清除之间失去平衡，导致植株衰老。其中温度是植物生长过程中重要的因素之一，经过自然进化，每种植物都有其生长的最适温度，温度过高或过低，都会影响植株生长发育。前人研究发现，水稻灌奖期间的高温，会导致细胞内膜脂过氧化程度升高，酶系统和膜系统受损，叶绿素降解加快，叶片衰老加速（丁四兵等，。张黎萍等（研究发现，高温会使植株剑叶丙二醒含量增加，而超氧化物歧化酶活性降低，植株衰老加快。持续黑暗也会引起植株体内叶绿素降解，加速衰老。研究表明，持续黑暗条件诱导转录因子的表达，将该基因过量表达时，转基因植株体内叶绿素含量下降减慢，叶片衰老减缓。通过超表达什绿体蛋白激酶，转基因后代在黑暗条件下也表现衰老延缓，。干旱也是影响植株衰老的重要因素之一，前人通过研究干旱对水稻抽穗后剑叶衰老的影响发现，干旱导致植株体内生理功能紊乱，剑叶衰老加速等现象文汉，。水稻生长发育需要从土壤中吸收各种营养元素，因而土壤中的无机盐和矿物质也影响其生长发育。研究表明，金属元素是通过改变细胞体内活性氧含量进而影响植株衰老。例如较为活泼的金属元素如和等，以及相对稳定的金属元素如和等，都能在植株体内能直接或间接产生，破坏细胞膜结构，引起衰老丨，。用处理水稻幼苗，可以诱发氧胁迫，导致根和奠的长度缩短，和活性增加。病虫害影响水稻吟片衰老的相关研究水稻生长环境中的昆虫、病菌等也会引起水稻的早衰。例如水稻纹枯病、稻菌核杆腐病等，这类病害危害芸杆基部，使塞秆组织腐坏变软，影响运输功能，导致植株早衰，严重影响稻米品质和产量（桑海旭等，水稻稻痕病、白叶枯病直接损害水稻叶片，加快叶片衰老，降低水稻光合效率，严重时甚至导致稻田绝收（；翟文学等，。二化娱、稻飞虱和稻纵卷叶頓被认作危害水稻的“三虫”，这三虫集中危害水稻吁片和客部组织，导致叶片功能破坏，蓋营养运输不畅，引起植株早衰。 1.5.5水稻叶片衰老相关基因的研究水稻衰老过程中涉及到大量基因的开启和关闭，等利用抑制差减杂交法签定获得个衰老相关的差异表达基因，其功能涉及大分子物质代谢、调控蛋白质合成、能量代谢、调节基因、解毒、病原性和逆境、细胞骨架构成和花发育等。水稻衰老过程中最显著的特征是叶绿素的降解造成叶片变黄枯萎，前人研究发现水稻中保绿基因会受到衰老诱导调控表迗，编码重要的结构蛋白参与叶绿体降解，该蛋白能够改变叶绿体内类囊体结构，影响什绿体数量（。水稻衰老过程中也伴随着蛋白质的降解。是植物体内形成复合体重要蛋白之一，在泛素蛋白质降解途径中起重要作用，。水稻中厂基因是五的同源基因，水稻一旦缺失呢兄，黑暗或过氧化氧对突变体诱导的叶片细胞死亡都被延缓，结果显示叶绿素降解速度变慢，表达量也降低。水稻衰老过程中氨基酸的降解对氣素的重利用有重要作用，对水稻生长发育具有重要意义。基因编码具有一个碟酸吼嚷酸结合结构域的蛋白质，该蛋白在衰老的叶片中特异性表达，在扬花期后表达量迅速上升，灌浆期达到最高。研究表明，灌浆期水稻叶片中转氨酶活性约为苗期的倍，说明在水稻灌装期，更多氧基酸参与到氣素的再利用中。编码经基苯丙酮酸双加氧酶，参与芳香族氨基酸的降解，其转录在灌浆期叶片叶绿素降解过半时才会出现，。此外，幻和均为水稻中谷氛酰胺合成酶基因，参与水稻细胞中氨基酸的降解，在衰老叶片中表达量下降，水稻突变体植株表现出生长能力和灌浆速率明显下降；存在于叶绿体中，其在衰老叶片中表达上升。此外，水稻衰老过程中还伴随脂代谢相关基因的激活，如由基因编码的半乳糖苷酶能水解脂类化合物，在自然衰老、黑暗和激素等诱导衰老条件下该基因均上调表达。此外，一些转录因子也参与水稻叶片衰老调控，如水稻锌指蛋白基因参与激素诱导的水稻衰老，超表达的转基因后代的叶片衰老被延缓，而被干扰的转基因后代则早衰，生理及分子结果表明，可能通过或至少部分通过整合发育信号与茉莉酸 甲醋信号传导通路来延缓叶片的衰老（。基因编码结合蛋白，参与细胞间物质运输，当过表达该基因时，水稻衰老提前，。迄今为止，已从水稻中克隆并经遗传转化验证或插入验证的叶片衰老相关基因有个（见表。影响水稻叶片衰老的其他因素转是植物进行生长发育的第二信使，自世纪年代韩调蛋白（尤其是转调素，被发现以来，人们认识到韩在调节植物衰老中也起到重要作用。研究证明，转不仅具有胞外功能，而且具有胞内功能，韩能够保持膜的稳定性，使质膜具有较好的离子选择通透性。适宜浓度的耗能够推迟和抑制乙稀和自由基等的积累，并保护活性氧清除酶（如和的活性，抑制植物叶片衰老（；梁颖等（和段咏新等（的研究证实，适宜浓度的韩离子能够有效抑制叶绿素的破坏，减缓水稻叶片衰老。而且钱离子能够提高水稻离体叶片中叶绿素蛋白含量，提高活性氧清除酶活性，降低两二酸含量，但随着韩离子浓度升高，作用则减弱，说明适宜的妈离子浓度是调节水稻叶片衰老的关键（段咏新等，。韩离子还可以和细胞分裂素相互作用调控水稻叶片衰老（彭新湘等，。糖作为植物生长发育的能源物质，其从植物源器官到植物库器官的正常转运，是维持植物正常生长的关键（，，例如水稻中基因参与東糖由胞腔到细胞质的转运，其突变体表现出胞腔内糖浓度升高，生长阻滞（，。另有研究表明，糖类可以和生长素等相互作用调控水稻生长发育，一方面，生长素可以调控糖类的合成和转运，如水稻中生长素合成和转运相关基因当该基因超表达时会引起水稻植株中糖积累，并引起糖合成和转运途径相关基因表达的改变进而影响水稻衰老（；另一方面，一些糖类也可以影响生长素的合成和运输，调控依赖于生长素诱导的植株生长发育（〖。等（研究表明，当将水稻糖转运家族中的一个基因超表达时，转基因水稻植株生长受到抑制，在苗期印出现早衰。 表水稻中克隆的衰老相关基因基因类别基因名称基因功能参考文献转录因子辞指蛋白，延缓衰老，延缓衰老，调控植物抗性反应，调控叶绿体形成和植物生长发育调控叶片衰老延缓黑暗诱导叶片衰老正调控叶片衰老引起斑点叶表型叶片早衰与互作，调控活性筑产，生，调节衰老参与吁片衰老，超表达时，植物早衰延缓叶片衰老蛋白醇或蛋白激蹄负调控叶片早衰参与黑暗胁迫诱导的叶片衰老，参与非生物胁迫和黑暗诱导的叶片衰老参与自然条件、持续黑暗等诱导，的叶片衰老和互作，调控叶片衰老或结合蛋白促进水稻叶片衰老代谢加工降解基因调控叶绿素降解，促进衰老’调控叶绿体降解，调控叶绿体类囊体腹降解，调控外绿体降解，调控叶绿体降解，参与叶绿素和光复合蛋白的降解水稻保绿基因调控叶绿素蛋白复合体降解，负调控叶片早衰丁，负调控叶片早衰衰老上调基因孙波等，衰老下调基因，物质转运相关基因与小亚基互作调控叶片早，催化作用相关基因调控活性氧秀导的叶片衰老生物合成相关基因】参与叶绿素的合成，与互作，调控叶片衰老 此外，水稻是一个完整的个体，各个器官之间相互作用，其他器官的生长受阻同样会引起水稻叶片的早衰。根系作为吸收水分和矿物质的主要器官，对植物衰老起到至关重要作用。前人研究发现，促进水稻根系建成、提高根系活力可以延缓水稻叶片衰老进程段留生等，抽穗期后，若能保证水稻根系活力旺盛，则其功能吁衰老进程减缓，植株体内和活性增加，含量较低，水稻产量会相对提高许乃霞等，。此外，研究证明，水稻叶片的衰老也会受到生殖器官或储藏器官等发育的影响段留生等，本研究的目的及意义本研究利用福射诱变获得的早衰突变体为材料，借助图位克隆技术及遗传转化技术证实由于基因的编码区碱基缺失导致其功能丧失进而引起叶片早衰。同时从生理生化水平和组织细胞水平解析引起叶片早衰的生理生化机理。此外，还研究了该基因与叶片刺毛生长发育的影响。这些研究将为深入了解基因的功能，探索引起水稻叶片衰老的分子生理机理提供实验依据，为培育延缓水稻衰老的新材料提供理论依据。 2材料与方法实验材料与田间种植从福射诱变籼稻品种的后代中获得叶片早衰及干旱敏感突变体经杭州和海南多代自交和回交获得遗传稳定的株系。之后利用为母本，分别与其野生型和常规粳稻品种杂交，获得并自交获得，对和群体进行遗传分析，并利用名的群体进行基因定位。年和年将突变体及其野生型、年将上述两个群体及其亲本分小区种植于浙江大学紫金港校区农业实验站浙江杭州。每个亲本材料重复次，每个重复行，每行株；两个群体的田间种植不设重复，单本插植。年和年的试验均为月日播种，月日移栽，由于突变体比野生型的生育期约晚周，为了生理试验的取样一致性，故年野生型的播种和移栽日期均后移周，而两个群体及其他亲本的播种和移栽日期均同年。所有材料栽插密度为，大田常规水作管理，及时防治病虫和杂草。试验地前苕为油菜，地力中等偏上。年和年在水稻成熟时，取每个材料株，调查生育期、株高、单株有效穗数、穗粒数、千粒重、结实率等主要农艺性状。年在水稻生长至抽穗期，对突变体及其野生型取不同叶位叶片，测定有关生理指标，并进行组织化学染色以及透射电镜分析；同时，对两个群体分单株观察其早衰表型并取样，提取用于后续基因定位分析。水稻幼苗的干旱胁迫处理模拟干旱胁迫选取突变体及其野生型的成熟种子发芽并在，营养液中培养，挑选生长基本一致的两叶一心幼苗在含有的营养液中培养，周后分别调查株高和根长并观察拍照。培养条件为白天°、光照晚上°、黑暗。每个处理重复次。 2.2.2自然干旱胁迫选取突变体￡及其野生型的成熟种子发芽并在营养液中培养，挑选生长基本一致的两叶一心期幼苗种在土壤里，（和各株。自然条件下正常生长一月后停止淺水，持续干旱天，而后正常烧水恢复生长天后统计野生型和突变体植株的存活数并拍照。叶绿柰含量测定分别选取株均处于抽穗期当天的野生型和突变体主蓋倒、倒和倒全展叶测定叶绿素含量，具体测定方法参考张治安和陈展宇（的《植物生理学实验技术》。分别剪取去除中脉的上述水稻叶片，剪碎，放在研钵中，加石英砂和礙酸韩少许，丙酮，研磨成匀架，然后过滤到棕色容量瓶中，用两酮洗研钵和滤渔次，再加°。两酮定容至，即为色素提取液。用日本岛津公司的紫外分光光度计分别测定和两个波长处的吸光度，按下列公式计算叶绿素浓度：叶绿素含量单位为：活性、活性和活性的测定分别选取株均处于抽穗期当天的野生型和突变体主签倒、倒和倒全展叶进行、和活性测定，测定方法参考《植物生理学实验技术》陈建動，。称取水稻样品剪碎，放入预冷的研体中，加入适量预冷的碟酸缓冲液（冰浴研磨成句浆。残渣再用碟酸缓冲液提取两次，合并三次勻浆液，以低温离心，上清液即为粗酶液，定容至粗酶液存于低温下备用。每个指标测定个重复。 2.5组织化学染色抽穂期当天剪取突变体《￡及野生型主塞倒二叶中上部长叶片，进行组织化学染色。染色方法参考等、等和等的方法进行台盼蓝、及染色。每个试验重复次。染色方法简述如下：台盼蓝染色：将离体的水稻叶片浸染在浓度为台盼蓝染色液中染液配制方法：台盼蓝染料，孔酸，水饱和粉，甘油，加水定容至，°抽真空，真空状态持续，缓慢释放，重复次。然后将样品置于沸水中，之后冷却之后将样品放置于水合氯酸水溶液中脱色天，拍照，甘油保存。染色：将样品置于的染液中染液配置方法：染料，用的碟酸缓冲液溶解并定容至，抽真空，真空状态持续，缓慢释放，重复次，之后黑暗处理个小时，于°利用乙醇脱色，至叶绿素被完全脱掉，拍照。染色：将样品置于染液中（染液配置方法：染料，溶解于的碟酸缓冲液，并定容至，抽真空，真空状态持续，缓慢释放，重复三次，之后黑暗处理个小时，于°利用乙醇脱色，至叶绿素被完全脱掉，拍照。可溶性蛋白含量测定抽穗期当天剪取突变体及野生型主墓倒、倒和倒全展叶进行可溶性蛋白含量测定。称取水稻样品剪碎，放入预冷的研钵中，加入适量预冷的構酸缓冲液（冰洛研磨成匀浆。残渔再用磷酸缓冲液提取两次，合并三次句浆液，以低温离心，上清液即为蛋白提取液，定容至，蛋白提取液！：存于低温下备用，采用考马斯亮蓝染色法测量蛋白浓度。 2.7MDA含量测定抽穗期当天剪取突变体及野生型主芸倒、倒和倒全展叶进行含量的测定。称取水稻样品剪碎，放入预冷的研钵中，加入和少量石英砂，研磨成勻浆，再用冲洗研钵两次，合并三次匀裝液，以低温离心，上清液即为粗提液，定容至，粗提液存于低温下备用。取上清液对照加蒸僧水，加入溶液，混勻后于沸水浴上反应至有小气泡产生后计时），迅速冷却后再离心。取上清液测定、和波长下的吸光度值。的浓度按下列公式计算：的浓度（含量浓度）提取液总体积反应液总体积植物组织鲜重反应中提取液体积叶片扫描电镜观察抽穗当天剪取突变体及其野生型主塞剑叶中部靠主脉约处的样本，放入用的攝酸缓冲液配制的戊二酸溶液中，抽真空至样品完全浸没，：下固定。按照下列步骤处理样品：倒掉固定液，用口的碟酸缓冲液漂洗三次，每次。用的锇酸溶液°下固定样品。倒掉固定液，用的碟酸缓冲液漂洗三次，每次。分别用、、、和的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理完后用的乙醇处理两次，每次。用乙醇与醋酸异戊醋的混合液（处理样品，再用纯醋酸异戊醋处理样品。样品放入样品篮中，零界点干燥小时。用镊子将样品枯于样品台上并喷金。利用日本生产的扫描电镜中观察处理好的样品。 2.9叶片透射电镜观察抽穗当天剪取突变体及其野生型主蓋剑叶中部靠主脉约处的样本，放入用的碟酸缓冲液配制的戊二酸溶液中，抽真空至样品完全浸没，°下固定。按照下列步骤处理样品：倒掉固定液，用的碟酸缓冲液漂洗三次，毎次用的锇酸溶液°下固定倒掉固定液，用的祷酸缓冲液漂洗三次，每次分别用、、、和的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理；完后用的乙醇处理一次。而后利用纯丙酮处理。用包埋刻与丙酮的混合液（处理用包埋剂与丙酮的混合液（处理纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，°加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在超薄切片机中切片，获得的切片，该切片经梓檬酸银溶液和醋酸双氧钻乙醇饱和溶液各染色即可在型透射电镜中观察。和激素处理将突变体和野生型的成熟种子去壳并消毒之后放在含和不同浓度激素的培养基上生长。激素的浓度分别为！丨和和—”；的浓度为和。生长条件为光照，黑暗，温度为°。天之后统计根长和株高并拍照，同时取经处理培养基中生长的（《突变体和的最下部的第一片叶片进行扫描电镜观察。样品处理按照进行。此外，将突变体和野生型的成熟种子去壳并消毒之后分别生长在多效哩的培养基中生长。生长条件为光照 16h，黑暗，温度为°。天后取突变体《植株与植株相同叶位全展叶样进行扫描电镜观察，按照进行样品处理。和提取在大田分单株剪取定位群体中具有突变体性状的早衰单株、双亲以及群体中株正常植株的叶片，采用等，的法提取基因组总。同时，分别选取株正常植株和株具有突变体性状的单株的等量混合，构建正常基因池和突变基因池，用于基因连锁标记简选。的提取则采用试剂进行提取，主要方法简述如下：将组织置于液氣中充分研磨成粉末；将粉末转入的离心管，加入，充分悬浮；加入氯仿，用力摇秒，室温下放置°下离心分钟后取上清，并转入新的离心管；加入的异两醇，放置，度下离心后去上清；加的酒精充分洗，°下离心后去乙醇，风干后加水，保存备用。标记分析本研究利用对均匀分布于水稻条染色体上的标记其引物序列来自数据库（对突变体和粳稻秀进行多态性分析，利用稀选得到的多态性分子标记对正常池和突变体基因池进行连锁性分析，获得的连锁性标记用于进一步分析所有群体中突变极端单株。总反应体系为包括，约，上下游引物各。反应条件为：°变性°持续°持续°持续循环个数°延伸。产物经非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，银染后观察，。 2.13遗传图谱构建本研究从株的群体中获得具有早衰表型的单株，组成极端群体，进行基因定位。利用简选到的连锁分子标记进行遗传分析，获得每个标记的重组交换单株数。同时在数据库查找基因连锁分子标记在染色体上的具体物理位置以确定其排列顺序，结合每个标记的重组交换单株数确定乂五基因与连锁标记的顺序，构建基因定位图谱。候选基因的确定与测序候选基因注解参考数据库（和数据库以及数据库中水稻序列注解信息。基因被精细定位到水稻第号染色体长臂范围内，横跨和两个重叠群，根据日本晴序列，该区间内共有个开放阅读框（。对该区间个注释基因进行分析后，对其中的三个候选基因扩增后进行测序。反应体系为：上下游引物（模板反应条件为：°预变性°；。，；；共个循环；°，。产物经琼脂糖电泳并割胶回收，经纯化后进行测序，每个序列重复测三次。测序工作由上海桑尼生物技术有限公司完成。遗传转化载体的构建根据中的基因的全长的序列设计一对引物：上游引物和下游引物含有的酶切位点），利用技术从日本晴扩增获得基因的，并跑胶纯化获得片段；同时利用高保真酶用引物 OsLED-PF(5'-CAGTGGATCCGATCATTACAATTTGCCATA-3')(含有的酶切位点）和扩增日本晴基因组获得￡基因的启动子，并跑胶纯化获得片段；再利用融合技术，利用引物和扩展由片段与片段融合的产物，最终获得含有启动子和的片段，用和对纯化后的产物进行酶切，连入农杆菌质粒形成选择插入正确的质粒进行测序以确定正确的插入片段。同时利用农杆菌介导法转化农杆菌并用于转化突变体。对于载体的构建，则首先利用含有的酶切位点）和含有的酵切位点）从质粒中扩增获得片段，用和对纯化后的产物进行酶切，连入农杆菌质粒形成，酶切鉴定获得插入正确的质粒；然后，利用含有的酶切位点）和含有的酶切位点）从质粒中扩增获得片段，用和对纯化后的产物进行酶切，连入农杆菌质粒形成，酶切鉴定获得插入正确的质粒。同时利用农杆菌介导法转化农杆菌并用于转化野生型籼稻品种。水稻的遗传转化主要参考等（的方法并进行部分修改。程序简述如下：在含，的或培养基中诱导初生愈伤，培养条件是：光照小时，温度为°黑暗小时，温度为挑取单克隆含互补或质粒的农杆菌，°过夜培养；离心收集菌株并用进行悬浮；天初生愈伤在悬浮菌液中处理分钟，而后在培养基上共培养 50-55小时；共培养后的愈伤在含有的头抱霉素的或培养基中抑菌天；将愈伤转入含的潮霉素和的头抱霉素的篩选培养基中筛选培养轮每轮天）；将抗性愈伤转入含、、潮霉素固体培养基中进行再生培养；再生植株继续在营养液中培养并用于后续的分析。转基因植株表型鉴定将获得的转基因植株，印转基因植株和转入互补载体的转基因植株移栽到土里，进行正常水肥管理，并实时观察转基因植株表型，并分别与对照，突变体相比较，拍照。转基因植株扫描电镜将获得的乂￡￡皿转基因植株和互补转基因植株同时取样，进行扫描电镜样品处理。同时，剪取相同叶龄叶位的卡特拉斯（植株叶片和突变体植株叶片进行扫描电镜样品处理。取样方法和样品固定方法参照。样品制备之后进行扫描电镜观察，统计实验结果。 3结果与分析的表型和主要农艺性状田间种植情况下，分蘖期前突变体及其野生型表型基本一致，分蘖期后突变体除心叶及心下部的片完整展开叶外，其他叶片均出现不同程度早衰且始于叶尖与叶边缘变褐色，并在叶表面呈现不规则分布的红褐色斑点图，之后随着叶龄增长斑点面积增大至叶脉，最终整张叶片枯死图。至抽穗后突变体“整株所有叶片均早衰甚至枯死图。其主要农艺性状，如株高、每穗粒数、千粒重和结实率比野生型分別下降、、和生育期则比对照约迟周表。表突变体及其野生型的主要农艺性状性状野生型突变体野生型突变体生育期士±±±採高±±±±有效穩数±±±±结实率±±±±千粒重士±士±每德粒数±±土±在水平上差异显著。图不同生育期突变体及其野生型的表型：分葉期；开花后和：开花当天剑叶；倒二叶； 3.2渗透胁迫下的耐旱性在模拟干旱胁迫处理周后，突变体叶片在苗期就早衰图而野生型对照及未处理的突变体￡则生长正常图。与未处理的突变体相比，胁迫后的突变体《株高图：：和根长图分别下降和而胁迫后的野生型对照则仅比其未处理对照分别下降和。处理后的突变体株高和根长也分别比处理后的野生型对照下降和。野生型和突变体“两叶一心期幼苗移栽至土壤中恢复生长个月之后，进行缺水处理，即不淺水处理天。此时，野生型和突变体植株叶片均严重卷缩甚至枯死图，恢复淺水天后，野生型的存活率为而突变体的存活率仅为图，从而进一步证实突变体对干旱胁迫更敏感。图模拟干旱胁迫下突变体与野生型的表型。：正常条件下的植株表型；、和处理后的植株表型、株高和根长， WTosledWTosled——睡口丨■■■■图自然干旱胁迫下突变体与野生型的表型。在水平上差异显著。一尸正常条件下的植株表型；干旱处理天后表型；恢复淺水天后表型；处理后存活单株数叶绿素含量分析抽穗期突变体剑叶图和倒三叶图的叶绿素含量分别比其野生型低和，而叶绿素则分别下降和，叶绿素总含量分别下降和。而与野生型相比，突变体倒二叶图 4B)的叶绿素含量则高，叶绿素含量低，叶绿素总量差异不显著。□，’■图抽当天突变体及其野生型叶片的叶绿素含量剑叶；倒二叶；倒三叶。在水平上差异显著。对戶抗氣化酵、和活性分析由图可以看出，突变体及其野生型的活性随叶龄增加依次降低，但相对于其野生型，突变体倒二叶与倒三叶则分别下降和。由图及图可见，野生型的剑叶、倒二叶和倒三叶之间的活性和活性差异不显著，而突变体则极显著增加。与野生型相比，突变体的剑叶、倒二叶和倒三叶的活性分别增加、和而活性则分别增加、和。丨《「縫—￡：一图抽德当天突变体及其野生型吁片的、和活性：剑叶；倒二叶；倒三外。在水平上差异显著；在水平上差异显著尸 3.5组织化学染色分析通常健康的细胞因细胞膜完整而能够排斥台盼蓝，不被染成蓝色，因此台盼蓝是检测细胞膜完整性常用的生物染色试剂。突变体叶片出现深蓝色斑点图，说明其细胞的膜系统已不完整或细胞巳死亡。在的作用下还原生成不溶于水的蓝色二甲勝，因此可以检测植物体内的活性氧的积累。图显示突变体《叶片的部分组织细胞被染成蓝色，说明其体内存在—的积累。此外，能与反应生成棕红色的多聚产物，因此染色法是检测积累的细胞化学方法。从图看出，突变体叶片的部分组织细胞被染成棕红色，说明其中有的积累。图突变体及其野生型叶片的组织化学染色；：台扮蓝染色；染色；染色可溶性蛋白分析及含量分析图显示野生型的剑叶、倒二叶和倒三叶的含量基本一致，而突变体则依次显著升高。与野生型相比，除剑吁外，突变体《倒二叶和倒三叶的含量分别增加和。而随着叶龄增加，野生型和突变体的可溶性蛋白含量依次降低图但与野生型相比，除倒三叶外，突变体剑叶和倒二叶的可溶性蛋白含量分别下降和。 A隱口乏。。““⑶图抽穂当天突变体及其野生型叶片的及可溶性蛋白含量：剑叶；倒二叶；倒三叶。在水平上差异显著；在水平上差异显著。‘突变体与野生型吁片扫描电镜分析与野生型相比，突变体叶片上表皮和下表皮剌毛数量显著增多图。数据统计结果显示，抽穗期当天，水稻剑叶叶片上表皮，乂叶片上表皮下表皮图突变体和野生型叶片抽穗期当天剑叶叶表面的扫描电镜图叶片上表皮；突变体叶片下表皮；叶片上表皮；突变体叶片下表皮；黑色箭头：大剌毛；白色箭头：小刺毛， 表面大刺毛数量较增加，小刺毛数量增加图；而统计水稻叶片下表皮数据显示，野生型大刺毛数量为零，突变体大刺毛数量极显著多于，小刺毛数量相比极显著增加（。统计两叶一心期水稻植株表皮毛数量发现，叶片上表皮大刺毛（数量极显著多于野生型图；但小刺毛（数量为零，与野生型对照—致。通过比较两叶一心期和叶片下表皮剌毛数量发现，两者刺毛数量相等，均为零。，丨□■■■■。■——。。■■：丨‘图与突变体叶表面刺毛数量比较上表皮；下表皮；在水平上差异显著。上表皮—图苗期和野生型叶片叶表面的扫描电镜图 A；自然条件下自然条件下突变体多效哩处理后：多效唾处理后突变体：多效唾处理后小剌毛数量；白色箭头：小刺毛；突变体与野生型叶片透射电镜分析结果表明，野生型叶肉细胞内外绿体轮廟清晰且均贴壁分布，叶绿体内基粒片层清晰图而突变体肉细胞内，绿体膜结构异常，出现严重降解图取样时间为下午，植物已经进行了较长时间的光合作用。与野生型相比，叶肉细胞内淀粉颗粒小而少（图和，此外，突变体叶肉细胞内出现较多的唆锇颗粒图，且在细胞核周围出现了脂肪颗粒。—議图突变体与野生型叶肉细胞的超徹结构和野生型和突变体：唾锇颗粒；叶绿体膜；类囊体基粒片层 3.9SA和对突变体咖和的生长发育的影响在含有激素和的培养基生长天之后，与野生型植株相比，突变体植株表现出株高更矮，且根长变短表型，这种表型随浓度增加更加明显（图。数据统计分析表明，经处理之后，突变体株高比野生型降低根长比野生型对照降低图和；经处理之后，笑变体根长比野生型降低，株高比降低图和。在含有激素的培养基上生长天之后，与野生型对照相比，突变体株高生长受到明显的抑制（图。统计结果表明，经的〗八处理之后，突变体株高下降，野生型株高下降经的处理之后，突变体株高下降，野生型株高下降图。丨图处理后突变体与野生型的表型。，在水平上差货显著：正常条件下的植株表型；处理后表型；处理后表型；；株高；根长；； WTosled■—■■图处理后突变体与野生型的表型。在水平上差异显著：正常条件下的植株表型；处理后表型；处理后表型；；株高；； 3.IOH2O2对突变体和的生长发育的影响在含有和的培养基上生长天之后处理，与野生型对照相比，突变体株高受到明显抑制，极显著低于野生型（图。统计结果显示，经处理之后，与野生型对照相比，株高下降经处理之后，株高下降图□“■■■。■—，」图处理后突变体与野生型的表型。，在水平上差异显著：正常条件下的植株表型；处理后表型；处理后表型；株髙；；；； 3.11不同激素对突变体与野生型叶片表皮毛的形成与生长的影响正常生长条件下，与野生型对照相比，突变体￡幼苗期叶片上表皮刺毛数量均极显著多于野生型（图和，这个结果和抽穗期当天与剑叶扫描电镜结果一致（图和。但当用不同激素处理幼苗时，发现不同激素对叶片刺毛的发育起到不同的调控作用。多效哩，处理结果显示，对于上表皮，多效哩能显著抑制水稻幼苗刺毛的发育（图经过多效哩处理的突变体，其叶片上大刺毛和小刺毛生长均受到抑制，刺毛数量变为零图但经多效唾处理的野生型对照，其叶片上刺毛数量不受务响（图。而统计下表皮刺毛数量结果显示，经多效■坐处理之后，突变体大刺毛数量没有变化，均为零（图但小刺毛数量显著增多（函，叶片下表皮刺毛数量不受多效哩影响。 E?一工—图多效哩处理后突变体和野生型叶片上表皮的扫描电镜图，在水平上差异显著自然条件下自然条件下突变体多效哩处理后：多效唾处理后突变体；：多效哩处理后大刺毛数量；多效哩处理后小剌毛数量；黑色箭头：大刺毛；白色箭头：小刺毛；巾 E"1“口■■“图多效唾口：『处理后突变体￡和野生型叶片下表皮的扫描电镜图，在水平上差异显著：自然条件下自然条件下突变体多效哩处理后多效唾处理后突变体：多效哩处理后小刺毛数量；白色箭头：小刺毛；处理之后，扫描电镜结果显示，较未处理的突变体相比，处理后的突变体（其叶片上表皮大刺毛数量减少，小刺毛数量则增加近两倍图而经处理之后，叶片刺毛数量并没有发生变化，均为零图和。经处理之后，突变体￡和叶片下表皮刺毛数量未发生变化，均为零图。 WTControlTM-1000_x300300urnTM-1000_x300300umTreatment"SAmmmmimj’—丨：彳■‘：“丨上‘■图水杨酸处理后突变体和野生型叶片上表皮的扫描电镜图，在水平上差异显著：自然条件下自然条件下穿克体水杨酸处理后：水杨酸处理后突变体：水杨酸处理后大刺毛数量；水杨酸处理后小刺毛数量；黑色箭头：大刺毛；白色箭头：小刺毛； WTosledControlI''^kSOO200umxSOO200urnTreatmentwithSAI*500200umx500200um图水杨酸八处理后突变体；乂和野生型叶片下表皮的扫描电镜图，在水平上差异显著：自然条件下自然条件下穿克水杨酸处理后：水杨酸处理后突变体；处理之后，扫描电镜结果分析表明，能够诱导突变体植株刺毛数量的增加（图。突变体植株经处理之后，叶片上表皮大刺毛数量增加，小刺毛数量增加图和野生型对照叶片上表皮刺毛数量未发生改变，均为零图。经处理之后，野生型和突变体乂￡叶片下表皮刺毛数量未发生变化，均为零。 ■國關—￡￡■丨觀：：工，■图茉莉酸处理后突变体和野生型叶片正表面的扫描电镜图，在水平上差异显著：自然条件下；自然条件下突变体茉莉酸处理后：茉莉酸处理后突变；茉莉酸处理后大剌毛数量；茉莉酸处理后小剌毛数量；黑色箭头：大刺毛；白色箭头：小刺毛； 3.12转基因植株的表型分析为了进一步确定该基因是否调控水稻叶片衰老，本研究利用农軒菌介导的水稻组织培养系统将的干扰载体转入至袖稻品种卡特拉斯并获得了转基因植株。通过对转基因植株的表型进行鉴定。结果显示，转基因植株在三叶一心期时即出现早衰现象，衰老现象提前图。且叶片衰老的现象与突变体在田间早衰的性状一致。均为先在叶表面形成斑点，之后斑点进一步变多、扩大，最终蔓延至整张叶片（图。至水稻分藥末期时，转基因植株表现出非常严重的衰老，且可能由于叶片的早衰，转基因植株并没有分蘖。此外，本研究也构建了互补载体并将其转入到突变体中，获得了互补的转基因植株。将导入互补载体的转基因植株与突变体的表型进行比较。结果显示，当突变体￡出现衰老表型时，转基因植株并未出现早衰现象（图，通过比较叶片看出，转入互补载体的转基因植株叶片未出现衰老，而叶片出现严重衰老，叶表面产生衰老斑点（图，叶片由上往下，由叶尖至叶脉萎蔫枯死（图。转基因植株扫描电镜结果分析通过扫描电镜观察抽穗期当天野生型对照剑叶和突变体剑叶的表皮毛，结果表明突变体植株由于基因突变导致其叶片表皮毛数量增多（图。这说明，该基因可能负向调控水稻叶片表皮毛发育。因此，在获得转基因植株之后，本研究对转基因植株叶片做了扫描电镜观察。结果分析表明，转基因植株叶片，其上表皮和下表皮大刺毛数量均显著多于对照图。统计结果显示，转基因植株叶片上表皮，大刺毛数量较对照增加，叶片下表皮较对照增加图。 ——图转基因植株的表型苗期植株表型；转基因植株叶片；分蘖期植株表型；苗期互补载体植株表型；，：互补的转基因植棟叶片；， KasalathOsLED-RNAip.,.HMMMI跚□■■叶片正面叶片背面图幼苗期￡转基因植株与对照叶片上表皮扫描电镜观察植株叶片上表皮；￡皿转基因植株上表皮；植株叶片下表皮；￡转基因植株下表皮，黑色箭头：大刺毛 3.14遗传分析及候选基因测序及序列比对分析秀和（《两个杂交单株均表现正常，表明突变体叶片早衰性状由隐性位点控制。在的个单株中，有株表现叶片早衰，株表现正常，正常单株：早衰单株：而在（的个单株中，正常单株，早衰单株，正常单株：早衰单株：，。田间种植观察表明，早衰单株叶片均先呈现出红揭色斑点，后随着衰老加剧，红褐色斑点扩大、增多并逐渐形成坏死斑点。这两个群体的结果均符合孟德尔单基因隐性遗传的分离比例，证实受单隐性核基因控制。利用秀的代和的代群体作为定位群体，共得到株早衰单株。选取均勻分布于稻条染色体上的对引物逐条对和突变体进行多态性分析，利用篩选到的多态性引物分析正常基因池和突变基因池。结果发现在水稻第号染色体上的标记、以及在突变体基因池和正常基因池之间存在多态性，利用个早衰单株验证以上标记，初步把定位在和之间（图。为进一步定位基因，在和之间设计标记，发现有对引物在亲本之间存在多态性，利用这对引物对单株进行基因连锁分析，最终将基因定位在与之间，物理距离约其间含有和等两个图。根据日本晴序列，在该定位区间内有个注释基因，个编码转运体蛋白，个编码未知表达蛋白，个亮氨酸拉链结构蛋白，个结构蛋白，其他分别编码锌指蛋白、修复酶、家族蛋白、蛋白、重复蛋白、类马铃薯糖蛋白和植物果胶甲醋酶抑制蛋白表。通过分析区间内候选基因，本研究测定了三个候选基因。其中基因是相关基因，拟南界中研究表明，锌指蛋白基因参与拟南界中叶片的衰老调控。在对进行扩增之后，进行序列比对，发现在其区域有两个碱基的缺失。缺失造成移码突变，导致蛋白质序列发生变化。 表定位区间内的基因及功能注释基因号功能注释料——二‘画￡々￡■■■■■图候选基因测序结果比对分析 4讨论叶片衰老是叶片生长过程中的必经阶段，伴随叶片衰老，其体内的叶绿素含量、光合效率以及细胞膜系统的膜质组分均发生变化。叶片衰老的外在直接表现是叶色变黄、叶片衰老甚至枯死，而内在的表现则是叶绿体超徵结构发生明显变化甚至完全解体。本研究中的突变体从分蘖期开始早衰，叶尖和叶边缘逐渐变黄并伴有红褐色斑点（图，叶片中光合色素含量急剧下降，且相对于剑叶，倒二叶和倒三叶中的叶绿素含量分别下降和，而叶绿素含量则分别下降和图，说明突变体倒二叶和倒三叶巳早衰，这也与图的结果一致。而突变体倒二叶的叶绿素含量明显高于野生型对照，叶绿素的含量相反图，这可能是因为突变体叶片在衰老过程中，基于自我保护的机制，叶绿素在叶綠素还原酶的作用下转换成叶绿素，。台盼蓝染色是检验植物细胞膜完整性以及细胞死亡的有效方法，本研究中的突变体叶片部分细胞被染成深蓝色图，表明细胞膜系统巳经破坏，细胞已经出现死亡。超微结构进一步证实，突变体叶肉细胞的细胞膜边界不清晰，叶绿体中的嗜锇颗粒明显更多，叶绿体膜及类囊体基粒片层明显降解图。然而，叶绿体是植物，形成的主要场所之一，伴随衰老叶片叶绿体的解体以及其他逆境胁迫，叶绿体中的电子传递链将受到抑制，致使‘、和大量形成拓丨，而含量过高将进一步导致细胞膜的破坏、蛋白质和脂类的降解，加速细胞和植株的衰老（。由于活性氧含量急剧增加且不能被及时清除，导致含量快速增加，因此含量也是衡量植物衰老的指标之一，。在本研究中，相对于突变体剑叶及野生型，突变体倒二叶和倒三叶的含量极显著升高图，说明其体内自由基含量明显累积。在叶片衰老的进程中，自由基的多少间接反映其衰老程度，和染色分别能反映自由基和的积累。与野生型相比，突变体叶片部分细胞则分别被图和图染成蓝色和红揭色，说明突变体叶片中存在自由基和的累积。的积累会导致破坏性的氧化作用，而酶是清除的重要保护， 2013)。图结果显示除剑叶外，突变体倒二叶及倒三叶活性明显低于野生型，表明细胞清除的能力下降，致使大量积累，这不仅进一步证实了染色和染色的结果，也说明导致突变体叶片早衰的原因可能与酶相关。此外，本研究利用处理突变体与野生型对照之后，突变体植株表现出更为敏感表型，即株高变矮、根长变短（图。综合结果表明，：《的积累抑制了“植株生长发育，进一步佐证了组织化学染色和活性氧清除酶活性的测量结果。此外，可溶性蛋白在植物体内，是亲水性较强的有机物，它能显著增加细胞的缚水能力，束缚更多的水分而保护自我。然而叶片在衰老的进程中，一方面蛋白水解酶的含量增加，导致叶片中的和叶绿素结合蛋白等叶绿体中的蛋白不断被降解，另一方面蛋白质的合成也会不断减少，导致可溶性蛋白含量不断减少，因而蛋白质的含量尤其是可溶性蛋白质含量的下降是衡量叶片衰老的重要指标之一，。本研究中，突变体和野生型片叶片的可溶性蛋白含量的总体趋势是不断减少，而剑叶和倒二叶间则差异不显著图，究其原因可能是在水稻叶片衰老初期，可溶性蛋白含量减少缓慢汪缘。至于突变体剑叶中的可溶性蛋白质含量显著低于野生型（图，则可能是由于基因的突变，导致基因调控网络紊乱何秀英等，，。细胞内活性氧清除酶，能够清除活性氧或其他过氧化物自由基，保护膜系统完整；而另一重要抗氧化酶也与植物细胞膜脂过氧化息息相关，该酶不仅参与清除过氧化物，还能使转变为正常的脂肪酸而降低其对植物细胞的损害。前人研究巳经证实，水稻剑叶在衰老的初期，活性和活性显著升高，在抽穗达最高，而后则持续下降。因此，突变体衰老叶片的活性图和活性图显著增加的结果进一步证实了前人的研究汪缘，。锌指蛋白是一类结合有并且可以自我折叠成“手指”结构的功能蛋白，锌指蛋白在植物中的功能多样，作为转录因子参与植物生长发育。人们研究发现，植物中新型的锌指蛋白亚家族，调控植物细胞程序性死亡。通常情况下，这种结构的锌指蛋白含有多个保守的锌指结构，。拟南界中含有三个锌指结构域，其响应植物细胞中自由基信号诱导植物细胞；另有研究表明，通过 调控铜锌超氧化物歧化酶（，减缓了细胞中自由基累积，控制了细胞衰老（，前人通过进一步研究，发现了两个与相关的铸指蛋白结构基因，基因可以和互作影响拟南齐中活性氧积累，调控植物细胞死亡（和转录因子均正向调控植物过程，当将这两个基因超表达之后，均加速了植物衰老（另一个相关基因，通过参与活性氧信号转导过程调解植物衰老。总结前人研究发现，与植物细胞内活性氧的累积有重要关系，其可以直接或间接调控活性氧代谢，影响植物衰老。本研究所揭示的：五也是一个锌指蛋白，通过活性氧鉴定、组织化学染色以及活性氧清除酶的测定，结果进一步证实了前人研究。本研究构建了目的基因的干扰载体并获得了相应的转基因植株，转基因植株在三叶一心期就表现出衰老表型，且由于过早衰老，植株无法完成正常分蘖（图将基因互补载体转入突变体中得到的转基因植株在突变出现早衰性状时，未出现衰老表型（图，说明五参与调控叶片衰老。植物激素影响着水稻生长的所有阶段，其在水稻生长发育后期也起到重要作用。一些植物激素与自由基相互作用调控植株衰老，例如诱导产生，刺激水稻衰老（。有研究表明，在拟南界中，含量增加能够激活生物合成酶，进一步诱导衰老相关基因的表迗，诱发叶片衰老特征。此外，也是和植物衰老关系较为密切的植物激素，研究表明其及参与，同时也参与植株自然衰老。本研究中，突变体在和条件下，均表现出敏感表型，即株高生长和根系生长严重受抑。但是可能因为本研究中激素处理是在水稻植株苗期进行，因而并没有呈现出衰老提前表型，但实验结果足以说明，基因响应和激素信号调节水稻植株生长。干旱胁迫会对植物生长产生极大的影响文汉等，。本研究表明，模拟干旱处理后，较野生型对照相比，突变体植株生长受到明显抑制；且经模拟干旱处理之后，突变体早衰表型提前出现，且根系发育不良，株高明显变矮图，突变体较相比极不耐干旱。但是，考虑到模拟干旱条件与自然干旱毕竟不同，因此本研究利用土壤干旱实验对突变体和的抗旱性做了更近一步的鉴定。土壤干旱处理结果表明，在 干旱条件下植株存活率仅为，野生型对照存活率为，￡存活率极显著低于野生型对照图，进一步表明突变体对干旱胁迫敏感。由于植株耐旱性的改变通常是因为其叶片表面气孔数量和密度发生了改变（史金凤等，。本研究对突变体和做了叶片的扫描电镜观察。无论是抽穗期当天的剑叶上表皮扫描电镜对比图和图和，还是苗期相同叶龄叶位叶片的上表皮扫描电镜对比图和，叶片大刺毛和小剌毛的数量均显著多于野生型除此之外，抽穂期当天，乂植株剑叶下表皮大刺毛和小刺毛数量也显著多于野生型图和。这表明，由于基因的突变，植株叶片表皮毛发育产生了很大变化，可能对水稻叶片表面刺毛的发育起到抑制作用。为了进一步证实这个结果，我们将获得的转基因植株进行扫描电镜观察，发现转基因植株叶片与其对照相比，叶片上表皮和下表皮大剌毛（数量极显著多余对照图，这说明负向调控水稻叶片大刺毛发育。但是小刺毛数量，却没有明显差异，这可能是因为：一，取样时间较早，叶片表皮毛发育较慢，小刺毛还未能完全发育；二，小刺毛和大刺毛的发育机制不一样（激素处理之后的扫描电镜结果也说明了这个道理）。前人研究表明，叶片表面刺毛发育与植物激素之间存在着重要关系，有些激素会刺激刺表皮毛发育，例如；有些会抑制植物叶片表皮毛发育，如多效■坐或者稀效哩，。本研究利用不同激素处理与突变体（《植株，并进一步观察其叶片表皮毛数量差异。结果表明，利用处理突变体会刺激叶片上表皮刺毛发育图，利用多效哩处理则显著抑制叶片上表皮刺毛发育（图，这和前人研究无异。但是，当用多效■坐（处理突变体时，其叶片下表面小刺毛数量增多，大刺毛数量未改变图和这可能说明，叶片上表皮和叶片下表皮刺毛的发育机制不一样，同时也说明响应激素多效哩（调控叶片表皮毛发育。这些结果表明，响应不同激素分别调控表皮毛发育，而且参与了多条调控途径。 5主要结论本研究利用突变体与粳稻材料秀杂交获得的群进行定位，成功分离出控制水稻叶片早衰的基因。该基因位于水稻第三号染色体上的长臂端，编码一个相关的锌指蛋白。研究结果表明该基因正向调控水稻植株对干旱的抗性，由于基因突变，突变体植株表现出极不耐干旱性状，而且这个性状并不是因为叶片表面气孔的改变（扫描电镜结果显示气孔数量和密度没有发生变化），可能是因为叶片表面剌毛的改变图。由于基因突变，导致突变体植株叶表面刺毛数量、密度增多，通过遗传转化实验获得的转基因植株，其叶片表皮大刺毛数量增多、密度增大，说明该基因负向调控水稻叶片表面大刺毛发育。植株叶片表皮毛的发育与植物内源激素有很大关系，因此本研究利用不同种类的植物激素对和突变体进行研究，发现基因相应不同激素对表皮毛发育起到不同的调控作用，但激素是如何调控水稻叶片表皮毛发育的，有待进一步研究。此外，利用、、激素对和“进行处理时，突变体株高和根长均受到很大抑制，且抑制程度随激素处理浓度增大而增强。这说明可能相应激素信号调节根系建成和株高生长。本研究证明，正向调控水稻抗旱性，负向调控水稻叶片早衰，这对于定向培育抗單水稻品种起到提示作用。如果将该基因在水稻植株内超表达，极有可能会获得具有抗旱性，并且具生育期后期功能叶衰老延迟表型的水稻植株，这对水稻生产实际具有重要的作用。但是，是如何调控水稻抗旱性、影响水稻叶片表皮毛发育，如何相应激素调控植株生长发育，有待于我们进一步的研究。 6参考文献陈杭芳和朱诚对月季花衰老及活性氧代谢的影响浙江农业科学，，陈建勁，王晓峰植物生理学实验指导广东：华南理工大学出版社，，丁四兵，朱碧岩，吴冬云，张嘉温光对水稻抽穗期后剑叶衰老和籽粒灌装的影响华南师范大学学报（自然科学版，，段辉国，黄作喜，林宏辉多胺在高等植物个体发育中的作用西北农业学报，段留生，韩碧文，何钟佩器官间关系对叶片衰老的影响植物学通报，段咏新，李松泉，付家瑞转对延缓杂交水稻叶片衰老作用机理杂交水稻，段咏新，宋松泉，付家瑞耗对杂交水稻离体叶片衰老的影响中山大学学报自然科学版，，段咏新和宋松泉转对延缓杂交水稻叶片衰老的作用机理杂交水稻，，高小宽水杨酸对不同品种小麦离体叶片衰老的影响江苏农业科学，，高小丽，孙健敏，高金峰，冯但利，柴岩，贾志宽不同基因型绿豆叶片衰老与活性氧代谢研究中国农业科学，勾玲，闰洁，韩春丽，赵瑞海，张旺锋，杨新军氮肥对新疆棉花产量形成期叶片光合特性的调节效应植物营养与肥料科学报郭振飞，卢少云，李宝盛，李明启三酮对绿豆幼苗叶片衰老的延缓作用植物学报，何秀英，徐世平，廖耀平，毛兴学，翁克难，陈创明，陈粤汉，肖万生水稻高压变异材料的标记和叶片可溶性蛋白质含量分析中国水稻科学，李付振一个水稻早衰突变体的遗传分析、定位及生理学研究博士论 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