蛋白含量测定及western步骤.doc

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1、蛋白的提取和定量肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPAbuffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。裂解液分装后保存于-70℃蛋白质定量：BCA蛋白测定法①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。③将标准品按0，2，5，10，15，20，25

2、ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品的溶液补足到25.1234567BCA(ul)2002002002002002002001mg/mLBSA02510152025ddH2O252320151050④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。⑤各孔加入200微升BCA工作液，37oC放置30分钟。同时打开酶标仪预热。注：也可以室温放置2小时，或60oC放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

3、⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）：总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul）RSB=1/5*总体积（ul）TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul）先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。最后放于-70℃保存。WesternBlotSDS-PAGE1.玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。2.按下表配制分离胶，浓缩胶。胶浓度ddH2O凝胶储备液Gelbuffer10%SDS10%APSTEMED浓缩胶4%(5ml)3.05ml0.65ml1.25ml50ul25ul10ul分离胶10%（10ml）4.1ml3.3m

4、l2.5ml100ul50ul10ul3.灌胶：将配好的凝胶溶液沿玻璃板长面灌入，为方便可将玻璃板向后倾斜，灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。状况好时往往能观察到水与胶的界限。4.分离胶凝固后，配制浓缩胶。将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。在此期间，打开水浴锅（100℃）注：此步后可停止，将胶连同梳子放入4℃保存一夜，若保存时间较长，为防止水分流失，可加盖湿润的滤纸和保鲜膜。5．电泳前准备好：待测蛋白、Marker、1＊runningbuffer。蛋白在沸水中煮3－5min。（第二次后不用煮沸）6．拔梳子，立即用1＊r

5、unningbuffer冲洗孔道（用塑料吸管）。7．将玻璃板取出，固定于电泳槽（短面冲里－相对），也要牢固，可先将电泳液倒入两玻璃板槽间观察是否渗漏。注：标记号1、2板及左右。8．固定好后，加样。跑道号码加入物质及体积13.5ulMarker(thermo#26616)2-1010ulSample9．玻璃电泳槽倒满1＊runningbuffer，电泳液没过电泳槽中的钢丝即可，注意标记好带的顺序。10.电极黑对黑红对红，电压100V电泳1－1.5h，等蓝色条带跑出后再等待10－15min。蓝带对应8KD蛋白，根据蛋白样品分子量决定具体的电泳时间，确保不让目标蛋白

6、抛出凝胶。一般可等蓝带完全跑出凝胶后10多分钟停止电泳。Western-ECL一、转膜1.玻璃板取出，用跷胶片打开，标记好切胶位置，将浓缩胶和分离胶上的空白切掉。切胶时不要划，要切。注意，在右上角切口标记，量胶的长、宽。2.将切好的胶（粘在一片玻璃板上）浸入Transbuffer，晃动使胶脱离下来，放上摇床，中速30min。3.根据胶的长宽剪滤纸和PVDF膜（不能折，不能用手碰），PVDF膜的右上角与胶一样切口。滤纸不能太大，膜可以大一点。PVDF膜甲醇激活，transbuffer摇床10min。将滤纸浸入Transbuffer。（Transbuffer不倒掉

7、）4.转膜装置:①滤纸可以采用学校的大张滤纸剪裁，四层叠在一起使用②三明治由低层向高层为：四层滤纸――膜――胶――四层滤纸，大小要一致③滤纸、膜、胶都需要用TRANSBUFFER浸透，上面滴加TRANSBUFFER④100伏转印60分钟。⑤如果转膜结束后不立即做，可以用TRANSBUFFER洗一洗，PBST洗一洗，晾干，保鲜膜包好后置四度保存。再用之前，甲醇激活，再用TRANSBUFFER洗一洗，PBST洗一洗。即可封闭二、杂交1.将10*TBS稀释至1*（100ml→1000ml），加入1mlTween20（0.1％），即TBST。（Tween较粘稠，把枪头

8、剪掉一块。）2．配封闭液，脱脂奶粉5g