DB22∕T 2909-2018 H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41备案号：62754-2019DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2909—2018H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法本标准仅供内部使用不得翻印Methodofthereal-timePCRforthedetectionofHAandNAgenesofAvianinfluenzasubtypeH5N82018-11-12发布2018-12-30实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2909—2018本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-20

2、09和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由长春海关（原吉林出入境检验检疫局）提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：王伟利、姚贵哲、孟庆峰、刘金华、王岸英、王准、肖芳、马玲。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2909—2018H5N8本标准仅供内部使用不得翻印亚型禽流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法的原理、材料与试剂、仪器设备、样品、试验步骤和试验数据处理技术要求。本标准适

3、用于H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T19438.1禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3缩略语下列缩略语适用于本文件本标准仅供内部使用不得翻印RT-PCR：反转录聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）Ct值：每个反应管内的荧光信号达到的设定的阈值时所经历的循环数（Cyclethreshold）RNA：核糖核酸（Ribonucl

4、eicAcid）DEPC：焦磷酸乙二酯（Diethypyrocarbonate）HA：血凝素（hemagglutinin）NA：神经氨酸酶（neuraminidase）Taq酶：Taq脱氧核糖核酸聚合酶（ThermusaquaticusDNApolymerase）4原理根据H5N8亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列设计引物和探针，探针结合部位在扩增片段内部。HA基因和NA基因探针分别在5’端标记VIC和FAM荧光素作为报告荧光基团，3’端分别标记MGB和BHQ1作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收

5、，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。据此荧光PCR仪可实现对HA基因和NA基因的同步实时检测。5材料与试剂5.1材料5.1.1离心管（1.5mL、0.2mL）。1DB22/T2909—20185.1.2荧光PCR反应管。5.2试剂本标准仅供内部使用不得翻印5.2.1裂解液5.2.2阴性对照：可采用健康的动物组织材料或经灭活的不含禽流感病毒的鸡胚尿囊液。5.2.3阳性对照：非

6、感染性体外转录RNA，-20℃保存备用。5.2.4氯仿（分析纯）。5.2.5异丙醇（分析纯）。5.2.675%乙醇。5.2.7DEPC水：0.1%DEPC处理后的去离子水。5.2.82×RT-PCRBuffer5.2.9RTEnzymeMix5.2.10Taq酶5.2.11引物与探针：HA基因：引物F1：5’–CTTGCGACTGGGCTCAGAAAT–3’；引物R1：5’–TTTGGGTGGATTCTTTGTCTGC–3’；探针P1：VIC-CATTCCTTGCCATCC-MGB；NA基因：引物F2：5本标准仅供内部使用不得翻印’-CTCCAAGAGGGGAAGATGCT-3’；

7、引物R2：5’-CTGACCTGGAGGTTCGACTA–3’，探针P2：FAM-CGCCCCACCCACACATCAGTTCCCTGT-BHQ1，6仪器设备6.1旋涡振荡器。6.2高速冷冻离心机。6.3微量可调移液器(10µL、100µL、1000µL)。6.4超低温冰箱（-80℃）。6.5荧光定量PCR仪。7样品抽样按照GB/T19438.1规定执行。8试验步骤8.1核酸抽提8.1.1酚氯仿法8.1.1.1取灭菌的1.5mL离心管（5.1.1），做好标识。8.1.