DB22∕T 3052-2019 脑膜炎奈瑟菌检测 实时荧光PCR法.pdf

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1、ICS07.100.10C04DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3052—2019脑膜炎奈瑟菌检测实时荧光PCR法DetectionofNeisseria-meningitidisinreal-timefluorescentpolymerasechain本标准仅供内部使用不得翻印reactionmethod2019-05-27发布2019-06-17实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3052—2019本标准仅供内部使用不得

2、翻印前言本标准按照GGB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省卫生健康委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：张炜煜、杨修军、刘桂华、王慧、张立夫、王艳秋。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3052—2019本标准仅供内部使用不得翻印脑膜炎奈瑟菌检测实时荧光PCR法警示——使用本标准的人员应该有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采

3、取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了脑膜炎奈瑟菌实时荧光PCR法的试剂和材料、仪器设备、试验步骤和数据处理技术要求。本标准适用于在生物安全二级实验室或以上防护级别的实验室中进行流行性脑脊髓膜炎疑似病人的脑脊液、血液、咽拭子样本中脑膜炎奈瑟菌检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法本标准

4、仅供内部使用不得翻印GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术应用3原理根据脑膜炎奈瑟菌荚膜转运基因（CtrA）的保守序列，设计TaqMan荧光探针和引物。PCR扩增时，Taq酶的5'端-3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光监测系统可接收到荧光信号。荧光信号累积与PCR产物形成同步，实时在线监控反应过程，对扩增产物进行分析。4试剂和材料除特别说明以外，所有试剂为分析纯或生化试剂。4.1细菌基因组DNA提取试剂盒。4.20.1%

5、DEPC处理后的去离子水，符合GB/T6682中一级水的规格。4.3FastTaqManMixture(LowROX)。4.4阳性质控品：脑膜炎奈瑟菌标准菌株。4.5阴性质控品：非目标菌株。4.6引物和探针序列：1DB22/T3052—2019细菌名称序列扩增产物本标准仅供内部使用不得翻印长度/bp脑膜炎奈瑟菌F:5'-GGTATATCGTGTGAATATGGCTGATG-3'97R:5'-GGCGCATTCGACACATACAA-3'Pb:5'-(FAM)CGCTATTTTCTATGCAGCGCTTTC

6、CTGTG(SpC6)-3'注：上下游引物和探针工作液浓度均为10μmol/L。5仪器和设备5.1.1Ⅱ级生物安全柜。5.1.2荧光定量PCR仪。5.1.3涡旋振荡器。5.1.4冰箱（2℃～8℃和-20℃）。5.1.5离心机(13000rpm)。5.1.6微量可调移液器及配套带滤芯吸头（10μL，100μL，200μL，1000μL）。5.1.7金属浴或水浴锅。5.1.8离心管（1.5mL）。5.1.9荧光PCR反应管和盖。本标准仅供内部使用不得翻印6试验步骤6.1样品6.1.1培养物用接种环挑取培养基上

7、疑似菌落，置于含200μL无菌双蒸水的离心管（5.5）中，用涡旋振荡器（5.3）振荡混匀。6.1.2血液采集3mL～5mL静脉血置于抗凝管中，并标记。6.1.3脑脊液应由经验丰富的专业人员在无菌条件下操作。采集1mL脑脊液置于无菌、螺帽管中，并标记。6.1.4咽拭子将咽拭子绕过口腔悬雍垂擦拭后壁，并置于底部滴加3滴～5滴无菌生理盐水的试管中，待检。6.2DNA提取对于上述标本，在Ⅱ级生物安全柜（5.1）取0.1mL（5.6）加到一个盛有0.2mL无菌双蒸水的离心管中（5.8）中，振荡混匀，用金属浴或水浴锅

8、（5.7）100℃煮沸10min，使用离心机（5.5）以13000rpm/min离心5min，可吸取上清液作为DNA模板。也可使用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备DNA模板。不能及时检测的DNA模板可置于-20℃冰箱（5.4）保存。2DB22/T3052—20196.3Real-timePCR扩增6.3.1Real-timePCR反应体系本标准仅供内部使用不得翻印Real-timePCR反应体系：20μL。其中，F