产纤维素酶菌株的诱变选育及内切葡聚糖苷酶分离纯化研究.pdf

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1、产纤维素酶菌株的诱变选育及内切葡聚糖苷酶分离纯化研究Study0nmutationbreedingofcellulase—producingstrainsand●』-J●^1●PurmCanon0t-enn0—2IUCanaSe2011年4月v一一j合肥工业大学本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合合肥工业大学硕士学位论文质量要求。答辩委员会签名：(工作单位、职称)一胁孕’委员：卷铷锋矛卜；叉巨导中国科学技术大学教授副教授教授独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果

2、。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得合肥工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者躲姘枚签字魄洲年乡月歹7日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解金胆王些走堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权金胆王些塞堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，

3、可以采用影印、』缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。。一(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：脚敖．签字日期：olol1年年月刁日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：签字日期：电话：邮编：产纤维素酶菌株的诱变选育及内切葡聚糖苷酶分离纯化研究摘要植物纤维素作为自然界中利用潜力最大的可再生资源，每年全球产量高达5×1010吨。有效转化和利用这些丰富的资源，对于解决人类面临的能源危机、食品短缺、环境污染等有着非常重要的意义。近年来，利用纤维素酶高效分解农作物秸秆产糖已经成为国

4、内外研究重点。然而，纤维素酶酶活较低是导致其生产成本过高，限制其大规模使用的主要原因。针对这个问题，本文以康宁木霉为出发菌株，分别从菌株诱变选育、发酵产酶条件优化、CMCase的分离纯化及酶学性质研究的角度进行了研究和讨论。1．利用N+注入技术对康宁木霉孢子进行诱变处理，用不同剂量N+注入后，菌体存活率呈现“马鞍型’’曲线，综合考虑菌株的存活率、总突变率和正突变率，确定最佳诱变剂量为12．5×1014ions／era2。在最佳诱变剂量下对康宁木霉孢子进行反复诱变，筛选得到一株遗传稳定性良好的高产菌株HF．6，

5、发酵120h，其滤纸酶活及CMCase酶活分别为O．217U／mL及3．526U／mL，较出发菌株分别提高49．66％及42．81％。2．在单因素试验基础上通过Plackett．Burman设计法对影响突变株HF．6产纤维素酶的主要因素进行筛选，得到三个影响显著的因素分别为pH、硫酸铵浓度和装液量。利用Box．Behnken设计法对这三个影响显著的因素进行响应面优化分析，确定突变株HF．6产纤维素酶的最佳发酵工艺参数为：玉米秸秆20g／L，麸皮20∥L，硫酸铵4．43g／L，硫酸镁O．5g／L，磷酸二氢钾0．

6、5g／L，乳糖4g／L；初始pH5．75，接种量2mL，培养温度29℃，装液量65mL，转速210r／rain。将突变株HF．6在最佳发酵工艺参数下进行发酵，其滤纸酶活及CMCase酶活分别为0．231U／mL及3．977U／mL。3．采用硫酸铵分级沉淀、SephadexG．100凝胶过滤层析及HiTrap啪QHP阴离子交换层析的方法依次对康宁木霉突变株HF．6所产CMCase进行了分离纯化，最终获得电泳纯CMCase，纯化倍数为7．144倍，回收率为13．828％，经SDS．PAGE凝胶电泳显示CMCase

7、分子量为58．8kDa。4．酶学性质研究表明：CMCase最适反应温度为50℃，在60℃以下时，酶能够保持相对稳定；最适反应pH为5．0，在pH4—7，4℃保存20h剩余相对酶活仍在60％以上。不同金属离子对CMCase具有不同的影响，Ca2+、M92+及Mn2+对CMCase酶活有激活作用，其中Ca2+的激活作用最大；Zn”、Cu2+、Fe3+及C02+对CMCase酶活有抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最强烈：Na+对CMCase酶活没有太大影响。CMCase对底物CMC的动力学常数Km及最大反应速率Vm

8、ax分别为2．254mg／mL及0．0382mg／min／mL。关键词；康宁木霉；离子注入诱变；纤维素酶；发酵条件；分离纯化StudyonmutationbreedingStralnSandpurlttcadonJ●■⋯■ofcellulase·—producingofendo-—glucanaseABSTRACTAsthemostpotentialrenewableresourcesinthena