利用Gateway技术构建黄瓜HPL基因的RNA干扰载体_王聪颖.pdf

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1、西北农业学报２０１３，２２（２）：１５２－１５８ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＢｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓＳｉｎｉｃａ利用Ｇａｔｅｗａｙ技术构建黄瓜ＨＰＬ基因的ＲＮＡ干扰载体＊?王聪颖，陈书霞，陈巧，郝丽宁，孟焕文，万旭花，申晓青，程智慧（西北农林科技大学园艺学院，农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，陕西杨凌７１２１００）摘要为探讨黄瓜脂氢过氧化物裂解酶基因（ＨＰＬ）下调表达对黄瓜果实挥发性醛类物质合成的影响，设计１对特异引物，以黄瓜ｐＤＯＮＲ２０１－ＨＰＬ质粒为模板，通过ＰＣＲ扩增出３２３ｂｐ的片段。利用基于同源重

2、组原理的Ｇａｔｅｗａｙ技术，将扩增的片段通过ＢＰ反应连接到入门载体ｐＤＯＮＲ２０１中。对扩增出的３２３ｂｐ的片段进行测序，测序结果显示该序列与原序列同源性为１００％。在此基础上，通过ＬＲ反应将目的片段插入过表达的植物ＲＮＡ干涉载体ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ８，构建黄瓜ＨＰＬ基因的ＲＮＡｉ表达载体ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ８－ＨＰＬｉ，分别经限制性内切酶ＸｈｏⅠ、ＸｂａⅠ酶切后获得３２３ｂｐ的片段，与预期结果一致。采用热击法将ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ８－ＨＰＬｉ转化农杆菌ＧＶ３１０１，经菌液ＰＣＲ扩增获得３２３ｂｐ的目的条带，表明ＲＮＡｉ表达载体ｐＨｅｌｌｓｇａ

3、ｔｅ８－ＨＰＬｉ已成功转入农杆菌中。关键词黄瓜；ＨＰＬ基因；ＲＮＡｉ干扰；克隆载体；表达载体；Ｇａｔｅｗａｙ技术中图分类号Ｑ９４３．２；Ｓ６４２．２文献标志码Ａ文章编号１００４－１３８９（２０１３）０２－０１５２－０７ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＲＮＡｉＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＨＰＬＧｅｎｅｏｆＣｕｃｕｍｂｅｒＵｓｉｎｇＧａｔｅｗａｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＷＡＮＧＣｏｎｇｙｉｎｇ，ＣＨＥＮＳｈｕｘｉａ，ＣＨＥＮＱｉａｏ，ＨＡＯＬｉｎｉｎｇ，ＭＥＮＧＨｕａｎｗｅｎ，ＷＡＮＸｕｈｕａ，ＳＨＥＮＸｉａｏｑｉｎｇａｎｄＣＨＥＮＧＺｈｉｈｕｉ（Ｃｏｌｌｅｇｅｏ

4、ｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｌａｎｔＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｉｎＮｏｒｔｈｗｅｓｔＣｈｉｎａ，ＹａｎｇｌｉｎｇＳｈａａｎｘｉ７１２１００，Ｃｈｉｎａ）ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｂｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＰＬｇｅｎｅｏｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｖｏｌａｔｉｌｅａｌｄｅｈｙｄｅｓｉｎｃｕｃｕｍｂｅｒ，ａ３２３ｂｐｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｒ

5、ａｇｍｅｎｔｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｕｓｉｎｇｃｕｃｕｍｂｅｒｐＤＯＮＲ２０１－ＨＰＬｐｌａｓｍｉｄａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ．ＴｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＤＯＮＲ２０１ｖｅｃｔｏｒｖｉａＢＰｒｅａｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＧａｔｅｗａｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｉｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｔｏｔａｌｌｙｉｄｅｎｔ

6、ｉｆｉｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｏｆＨＰＬｇｅｎｅ．ＴｈｅｎｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｈｅｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＨｅｌｌｓ－ｇａｔｅ８ｖｉａＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｔｏｆｏｒｍＲＮＡｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ８－ＨＰＬｉ，ｗｈｉｃｈｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｒｅ－ｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅＸｈｏⅠａｎｄＸｂａⅠａｎｄｉｔｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ．ＴｈｅｐｌａｓｍｉｄｏｆｐＨｅｌｌｓ－ｇａｔｅ８－ＨＰＬｉｗａｓｔｒａｎ

7、ｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｒａｉｎＧＶ３１０１ｂｙｈｅａｔｓｈｏｃｋａｎｄｔｈｅ３２３ｂｐｆｒａｇ－ｍｅｎｔｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｑｕｉｄＰＣＲ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＣｕｃｕｍｂｅｒ；ＨＰＬｇｅｎｅ；ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；Ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；Ｇａｔｅｗａｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＊收稿日期：２０１２－０５－１７修回日期：２０１２－０６－１４基金项目：国家自然科学基金（３１０７１８１３）；高校基本科研业务费（ＱＮ２０１１０８８）；西北农林科

8、技大学国际合作基金（Ａ２１３０２１１０２）；陕西省留学人员科技活动项目择优资助经费（Ａ２８９０２１２０２）。第一作者：王聪颖，女，在读硕士，研究方向为