大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒ORF2片段的聚合现象研究.pdf

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1、!"卷#期生物工程学报’()*!"+(*#$%%$年&月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12,-).$%%$!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒!"#$片段的聚合现象研究李少伟张军何志强葛胜祥顾颖林鉴刘如石夏宁邵"（厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门B2!%%3）摘要在大肠杆菌中表达了戊型肝炎病毒（C8’）DE5$的6*6*B4#F6*6*2%#

2、片段，得到的重组蛋白+8$在GHG/IJK8中主要以可被尿素解聚的二聚体形式存在，二聚体对病人血清的反应性明显强于单体；质谱分析表明+8$可形成从二聚体到至少六聚体的多种聚体；动态光散射测定表明平均分子半径约#;9，相当于四聚体，但分散度较大，提示为多种大小不一的聚合体的混合物。这些证据表明+8$蛋白可形成以同源二聚体为基本单位的多种聚合体形式，其中以二聚体间的结合最为紧密，并且以二聚体为基础可进一步装配出多种更高级结构，从而具有作为C8’疫苗及诊断试剂抗原的良好前景。关键词戊型肝炎病毒，DE5$，

3、组装，二聚体，原核表达中图分类号L4B4M#文献标识码J文章编号!%%%/B%2（!$%%$）%#/%#2B/%3戊型肝炎是发展中国家的一种主要急性散发型是否依然形成二聚体，并是否可在二聚体基础上模肝炎，其病原体戊型肝炎病毒（C8’）主要经消化道拟病毒子粒的装配过程形成更高级的聚体形式乃至传播，是大小约$&FB#;9的单股正链无包膜的类病毒颗粒，本研究将该区段转移至一个非融合表E+J病毒，基因组全长约&M3NO，含B个开放读码框达载体Q0D/0&中，表达出无融合蛋白的8$多肽，并架（DE5），其中D

4、E5$编码22%个氨基酸的多肽从多个方面对该重组多肽的聚合现象进行了探讨。（IDE5$），为病毒主要结构蛋白。目前已有几个研%材料与方法究小组利用昆虫杆状病毒表达系统表达了+端部分缺失的IDI5$片段，并发现当表达片段的P端被%&%质粒与菌种昆虫细胞内蛋白酶剪切至6*6*2%&的产物能够形成含有C8’DE5$6*6*B4#F6*6*2%#基因片段的［!F3］类病毒颗粒。在过去的研究中，我们利用谷胱质粒QK8R$%0/8（$QK8$）为香港大学微生物系吴文［2］甘肽转移酶（KG0）融合表达载体在大肠杆

5、菌中表达翰教授惠赠，非融合表达载体Q0D/0&为本实验室［"］了DE5$的6*6*B4#F6*6*2%#的区域（8$）的重组蛋所构建与保存，受体菌3*0(,#8EE$322亦为本室白（K8$），发现其在GHG/IJK8中形成大量的二聚保存。体，而且二聚体与感染血清的反应性要大大强于单%&$引物体，提示该重组蛋白的二聚体形式有利于某些强构根据QK8R$%0/8$上C8’DE5$基因序列，由象型表位的暴露；用该重组蛋白免疫恒河猴，可以保上海博亚公司合成。3S端引物C85I（3S/PJ0J0K/护其抵抗高

6、滴度的C8’攻击而不发病，因此具有成PJKP0K00P0JP0P0PK0P/BS）引入酶切位点45%T，BS［2，&］为疫苗的良好前景。对昆虫细胞表达的C8’类端引物C8EI（3S/P0PKJKJJJ0JJJP0J0JJP0PPP病毒颗粒的研究提示C8’衣壳的基本形态单位（子KJ/BS）引入酶切位点6"(T。［3］粒）是在DE5$的同源二聚体基础上形成的，8$片%&’工具酶及其它段在GHG/IJK8中的二聚化现象以及其较单体形式限制酶、7+8H+J聚合酶和QUH!"/0载体为更好的血清反应性提示其可

7、能与C8’子粒的基本06V6E6产品，酶标记抗体购自晶美公司，为IED0DG结构具有较大的相似性。为探讨8$片段在溶液中产品。收稿日期：$%%$/%!/$#，修回日期：$%%$/%#/%!。"通讯作者。01)："2/34$/$!"#!!%；567："2/34$/$!"#!!%；8/96:)：;<7:6)=>:;?7:6;*79-*1@-*A;1@1生物工程学报9-卷!"#重组表达载体的构建!"9基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（:);’以质粒!"#$%&’(#%为模板，)#*+与)#,+为&<’=>

8、?’:%）引物扩增出-%-.!片段。+/,条件为：012预变性将!(氰基(1(羟基肉桂酸（)//M）溶于乙腈^3456；012变性3&7，382退火3&7，8%2延伸9456，共&G9R三氟乙酸（9：%，)=)）混合液形成饱和溶液即扩增%3循环；最后再8%2延伸9&456。+/,扩增片基质溶液，)+H/纯化的K#%经超纯水透析脱盐后段与!:;9-(’载体连接，得到插入#%基因的阳性与等体积的基质溶液混合，点于样品靶上，送入质谱亚克隆；再经!"#<=$%&,<酶切处理，